同组样本在流式图中位置不一

shiyisyl

各位老师，想请教个问题，
下图是我一次实验的样本，同一组小鼠，标记CD69，发现圈门之后，数据差异很大。
是小鼠个体差异，还是样本制备造成的？这种情况该怎么解决呢？FMO只做了一个样本，位置也不一样。
染色在同一个plate上进行的，染色液也是混成mix加的。

niwanmao

这种情况，在科研中好像确实不少见，在临床样本中也有出现过。

原因可能有：
1、仪器流动室的液路稳定性。
2、染色时操作影响，包括细胞密度、染色体积和抗体用量误差。

所以，现在有些人为了减少这种问题发生，采用多个样本barcoding标记后，混在一管内上机，减少这些影响。

Climber

在科研工作总同一组的小鼠甚至同一窝的小鼠差异大可太正常了，特别是有些疾病模型的小鼠，小鼠本身的个体差异就很大，分析的结果自然就组内差异很大，有明显怀疑小鼠状态、模型构建不成功、发育不正常或者与组内其他小鼠有差异的小鼠我们通常会舍弃，建议您这边把圈门逻辑做得更详细一点，尽可能的把非目的细胞和死细胞给排除掉，特别是死细胞带来的非特异性荧光问题，仅仅染一个B220和CD69似乎很难让审稿人满意，CD69我感觉效果还是很容易出的，这里附上我们最近做的一张图

shiyisyl

niwanmao 发表于 2022-7-24 15:41
这种情况，在科研中好像确实不少见，在临床样本中也有出现过。

原因可能有：

倪老师，我仔细看了这两个样本。A1细胞收了33万，A4收了57万。
每次收样设置：淋巴细胞20万、100uL体积，先触碰到任意一个，停止收样。
铺板时，加入的每孔细胞数确实不一样，有的孔数量差异较大（脾脏初始浓度从5*10^6~3x
10^7不等，并且ELISPOT实验先计数铺8孔，用剩下的1份脾脏细胞铺8孔做流式，每孔用不同刺激物刺激，目的是筛选刺激物），请问，这样操作，是否有问题？

shiyisyl

具体圈门策略见下图：

niwanmao

shiyisyl 发表于 2022-7-24 18:49
倪老师，我仔细看了这两个样本。A1细胞收了33万，A4收了57万。
每次收样设置：淋巴细胞20万、100uL体积， ...

个人建议：
铺板前，细胞密度调整一致。
收集细胞染色前，也将细胞密度调整一致。

这样再看看？

shiyisyl

niwanmao 发表于 2022-7-25 10:57
个人建议：
铺板前，细胞密度调整一致。
收集细胞染色前，也将细胞密度调整一致。

好的，我试试，有结果再回复，多谢倪老师！