CFSE检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖，增殖峰只有一个，怎么办

羊芈芈 · 发表于 2018-5-23 17:21:26

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最近在做小鼠脾脏淋巴细胞增殖的实验，分离得到小鼠淋巴细胞后，用1uM CFSE染色，然后洗涤，最后96孔板铺细胞（300000个细胞/孔），加终浓度5ug/ml的ConA刺激，37度培养3天后，流式检测。检测的结果如下：

cell+CFSE

cell+CFSE+ConA

cell+CFSE+ConA

这应该是增殖了吧，显微镜观察刺激租的细胞和不刺激的有明显的区别，可是为什么只有一个子代峰呢？

ghqiu09 · 发表于 2018-5-25 15:52:48

我觉得可能主要问题是细胞密度的关系，96孔板一个孔30万个细胞有点多了，你可以多做几个复孔或者用24孔板，96孔板一个孔一般在10万左右

niwanmao · 发表于 2018-5-23 19:28:51

左侧的群体峰分布如何？

羊芈芈 · 发表于 2018-5-23 20:58:22

niwanmao 发表于 2018-5-23 19:28
左侧的群体峰分布如何？

是说第一张图圈门所有细胞的峰形图吗？

羊芈芈 · 发表于 2018-5-23 21:08:47

羊芈芈发表于 2018-5-23 20:58
是说第一张图圈门所有细胞的峰形图吗？

cell+CFSE

cell+CFSE+ConA

这是对应的全部细胞的峰形图
第一张图是有三团细胞的，第一团和第二团有点黏在一起，第一团应该是死细胞，所以圈门的时候并没有圈。

niwanmao · 发表于 2018-5-23 21:25:33

羊芈芈发表于 2018-5-23 21:08
这是对应的全部细胞的峰形图
第一张图是有三团细胞的，第一团和第二团有点黏在一起，第一团应该是死细 ...

活细胞挺少的。只有10％不到。
但是活细胞应该是增殖了。至于一个峰，会不会是因为细胞死亡水平过高的缘故，导致无法支持更多子代分裂。

羊芈芈 · 发表于 2018-5-23 21:49:26

也有可能，那怎么解决呢？我已经做了好几次了，而且设置了CFSE的浓度梯度。还有就是加了刺激组的活细胞比未加刺激的多，是大于10%的。

羊芈芈 · 发表于 2018-5-23 21:50:41

然后我用modfit软件分析子代细胞，结果是没有第二代子细胞，有第三代和第四代子细胞，也很是纳闷

niwanmao · 发表于 2018-5-24 15:44:06

羊芈芈发表于 2018-5-23 21:50
然后我用modfit软件分析子代细胞，结果是没有第二代子细胞，有第三代和第四代子细胞，也很是纳闷 ...

因为一孔只有30万个细胞，你是否可以试试CFSE降低一半，减少对细胞的毒性。

羊芈芈 · 发表于 2018-5-24 16:04:03

之前更低的浓度梯度我也做过，增殖的细胞特别少，而且荧光强度比较弱。一般我是用3X10的6次方/ml的细胞来染的，然后铺96孔板的时候，每孔只铺30万个细胞。这个染色步骤，也是参考本网站之前老师您分享的一些相关资料和视频来做的。下图是CFSE终浓度为1uM的细胞增殖流式图。活细胞比例比之前发的那个高些。

cell+CFSE

cell+CFSE+ConA

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[细胞增殖] CFSE检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖，增殖峰只有一个，怎么办

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