CFSE脾脏淋巴细胞增殖图，向大家请教

甜鼠肉乎乎

我做的是脾脏淋巴细胞增殖实验，所用实验条件如下
小鼠脾脏细胞经过T细胞阴选试剂盒分选后，CFSE染色（两个浓度1.25和2.5微摩），细胞浓度设定两种，2×10⁵和4×10⁵，接种至96孔U型板（提前包被CD3/28，浓度均为5微克/毫升），然后加入实验所需要验证的抗原肽（浓度梯度为5，10，20微克/毫升），培养五天（第四天培养基变黄换新，所以第四天没有跑流式）。
画门方法如下，

整合后如下图

CFSE1.25 微摩 细胞密度为2×105

CFSE1.25 微摩 细胞密度为4×105

CFSE2.5 微摩 细胞密度2×105

CFSE2.5 微摩 细胞密度4×105

这个实验已经做了很久了，因为实验室没人做，自己摸索的觉得很难，目前得到的一些问题就是
1好像细胞浓度2比4好一些，但是先前看论坛里是细胞密度高一些更好。
2 原来没有加过CD3/28做过一次，因为想着比较抗原肽的增殖效果，加入其它的刺激就不合适了，但是做出来的趋势不好，这次就加了CD3/28。相对比感觉好像同时加入抗原肽的比单纯的CD3/28的增殖好那么一丢丢。不知道是不是我的错觉啊
3 做不出来文献中那种贴合很紧密的连续峰，不知道是哪里出了问题，难道是细胞不够纯吗，需要用CD4阳性的细胞分选后做吗？
4 不同的CFSE浓度得出的最好的增殖结果的实验条件好像不一样。CFSE1.25时，感觉细胞密度低一些，然后肽的浓度是5，培养5天的时候比较好。
CFSE2.5的时候，感觉细胞密度高一些的，然后肽的浓度是20，培养3天的时候增值效果比较好。不知道接下来用哪种条件做合适？
5 如果有其他BUG的话，我没有挑出来，非常希望大家能帮我指出来。

多谢多谢

CFSE和FVD

niwanmao

子代的细胞怎么这么少？

甜鼠肉乎乎

niwanmao 发表于 2019-5-8 09:47
子代的细胞怎么这么少？

非常感谢倪老师的回复，我用的培养基是IMDM+10%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%双抗，这个培养基配方您看有问题吗？
另外我的CD3/28包板子后没有吸出来，是不是细胞一部分刺激死了？因为好像只有倒数第二排图的子代细胞多一点，是不是也是不够？

niwanmao

甜鼠肉乎乎 发表于 2019-5-11 22:13
非常感谢倪老师的回复，我用的培养基是IMDM+10%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%双抗，这个培养基配方您 ...

不知道CFSE和FVD双参数图如何的分布？

甜鼠肉乎乎

niwanmao 发表于 2019-5-12 19:53
不知道CFSE和FVD双参数图如何的分布？

不好意思倪老师，我的FVD和CFSE的图上传在帖子的原文中了，麻烦您帮我看一下。P2门是去粘连细胞，然后画的FVD和CFSE。
另外有个问题想请教您和各位前辈，就是我如果想检验这个抗原肽对混合淋巴细胞的增殖能力的影响，同时加入CD3/28并做了同行对照可以吗？
另外我如果想检验这个抗原肽对TH17细胞的增殖能力影响，不知道应该选择哪个方式，有三个拟实行的方案：
1：一只健康小鼠脾脏混合淋巴细胞分选出CD4+T细胞后，CFSE孵育，分为对照组，CD3/28组，CD3/28+抗原肽组，培养三天后流式检测IL-17。
2：一只健康小鼠，一只造模小鼠，分别取脾脏混合淋巴细胞分选出CD4+T细胞，CFSE孵育，各加入抗原肽，培养三天后流式检测IL-17。

immunology

首先没懂楼主的图例到底是什么意思？楼主帖子中说CFSE浓度用了两个分别是2.5uM和5uM，图例上发现CFSE的浓度又变成了1.25uM和2.5uM，到底用的哪个浓度，因为我最近也做类似的实验，我发现终浓度为5uM的CFSE孵育细胞后，离完心，细胞沉淀特别的黄，不知道楼主有没有类似的体会，我在想CFSE浓度高也会对细胞有损伤作用。
再次，楼主在刺激第二天的时候有没有镜下观察过，细胞是否成簇成团明显，是否有大的淋巴母细胞存在，激活起来的淋巴细胞，由于聚集，与未刺激组相比，会导致孔中出现大量的留白，而未刺激的淋巴细胞在孔中分布比较均匀。
另外，楼主选用的FVD是什么光，是否与CFSE调过补偿了？我的经验是CFSE的补偿在某些通道非常高，CFSE比FITC的强度强的不是一星半点。
最后，如果淋巴细胞刺激起来了，楼主FSC-SSC圈门可能圈的有问题，刺激起来的淋巴细胞前侧向门上就不是原来的那一群了，而是靠后的一群。
我也是处于摸索中，与楼主讨论一下吧

甜鼠肉乎乎

immunology 发表于 2019-5-19 15:00
首先没懂楼主的图例到底是什么意思？楼主帖子中说CFSE浓度用了两个分别是2.5uM和5uM，图例上发现CFSE的浓度 ...

帖子已经进行修改，浓度是1.25和2.5，非常抱歉自己的不严谨造成大家的困扰
镜下观察就是在第3天的时候会有成团聚集前两天的不明显
FVD通道是KO525
请问你做的时候也是用健康小鼠的混合淋巴细胞刺激吗？

Cleopatra

immunology 发表于 2019-5-19 15:00
首先没懂楼主的图例到底是什么意思？楼主帖子中说CFSE浓度用了两个分别是2.5uM和5uM，图例上发现CFSE的浓度 ...

请问最近还在做CFSE吗？我一直在被这实验困扰，有时间可以一起讨论下吗？

qscdawx

之前做过一些人的T细胞增殖实验，效果不错，能看到明显的多次的增殖峰，可能会和小鼠有一些不同，但是可以给你一定的参考：
1，cFSE浓度过高会有毒性使细胞死亡，之前用的是2uM的浓度
2，CD3 CD28的浓度也需要你重新摸索，我们之前用coat 1ug/mL CD3和加2ug/mL 的CD28的激活效果已经很好了，coat 0.3ug/mL的CD3也能激活，相对要弱一些，感觉浓度太高，细胞也可能过度激活而导致死亡。
3，激活的细胞会明显的增大，再说你是阴选出来的纯化T 细胞，为什么不把所有的FSC/SSC都圈门了呢？
4，我们是用high binding的96孔板做的实验，因为之前做MLR的时候感觉U底板做的结果不是特别好

甜鼠肉乎乎

qscdawx 发表于 2019-7-18 13:54
之前做过一些人的T细胞增殖实验，效果不错，能看到明显的多次的增殖峰，可能会和小鼠有一些不同，但是可以 ...

多谢您的建议，我准备再试试看