人全血淋巴细胞上连续性表达Marker(如HLA-DR)圈门问题

kerrsun

倪老师您好，近期流式检测人全血中淋巴细胞亚群遇到一些问题，目的是检测CD4+T中HLA-DR阳性细胞的占比，原始数据如下
1.圈淋巴细胞




2.圈CD4T




3.圈HLA-DR阳性的CD4T (共3个样本)
sample1
   


sample2
   


sample3
   


如图所示，为保证圈门的一致性，DR+门的位置没有移动，但明显可见：按照sample1圈得门不适用于sample2/3
请问：这样的情况该如何正确圈门？
         如果每一个样本单独圈门，能否避免样本间由于圈门导致的不一致？
         类似于DR这样连续性表达的marker，圈门时应关注散点图还是直方图？

niwanmao

一共几色？建议用FMO设门。

kerrsun

染色方案：
CD3 PE/CY7
CD4 FITC
CD8 APC
CD19 PE/CY5
HLA-DR APC/CY7
ICOS PE
胞内某分子 BV421

那每一个样本都要做一个FMO对照吗？

kerrsun

niwanmao 发表于 2019-10-7 20:14
一共几色？建议用FMO设门。

染色方案：
CD3 PE/CY7
CD4 FITC
CD8 APC
CD19 PE/CY5
HLA-DR APC/CY7
ICOS PE
胞内某分子 BV421

那每一个样本都要做一个FMO对照吗？

niwanmao

kerrsun 发表于 2019-10-8 08:51
染色方案：
CD3 PE/CY7
CD4 FITC

样本性质相同，一次做一个FMO，设置HLA-DR的门。
如果你其它标记也需要设门分析比例，那么也做一个相应的FMO。

kerrsun

niwanmao 发表于 2019-10-8 20:53
样本性质相同，一次做一个FMO，设置HLA-DR的门。
如果你其它标记也需要设门分析比例，那么也做一个相应的 ...

倪老师，每一批样本做一个FMO的话，得到的就是一个固定的门。但这一个门在散点图上是否也难以符合每一个标本的形态呢？
（以上举例的流式图片就是同一天测的同一批样本）

niwanmao

kerrsun 发表于 2019-10-8 21:27
倪老师，每一批样本做一个FMO的话，得到的就是一个固定的门。但这一个门在散点图上是否也难以符合每一个 ...

细胞来源相同、处理方式相同（用同一种药物或同一种刺激方式），就可以用同一个门。

南瓜妹妹

niwanmao 发表于 2019-10-8 22:54
细胞来源相同、处理方式相同（用同一种药物或同一种刺激方式），就可以用同一个门。
...

倪老师，想请教您一个问题，全血细胞裂红后做检测单核细胞HLADR，HLADR的画门可以用同一管中的中性粒细胞的作为生物学阴性对照来画门吗？因为中性粒细胞HLADR是阴性的；还是必须用FMO来画门呢？

niwanmao

南瓜妹妹 发表于 2020-3-11 23:33
倪老师，想请教您一个问题，全血细胞裂红后做检测单核细胞HLADR，HLADR的画门可以用同一管中的中性粒细胞 ...

FMO+Fc Block这样组合最好。

中性粒由于自发荧光本底会有差异，只能作为大致判断，不能作为准确设门依据。

南瓜妹妹

niwanmao 发表于 2020-3-12 12:29
FMO+Fc Block这样组合最好。

中性粒由于自发荧光本底会有差异，只能作为大致判断，不能作为准确设门依据 ...

倪老师，是这样的，我做的是人单核细胞，用CD14和CD16 maker，之前我请教过您，您说分群明显不需要Fc blocking；意思是如果只看单核细胞分群不需要Fc blocking，如果做后续单核细胞其他表面分子表达还是需要Fc blocking吗？