2021诺奖发现的TRPV1，流式能够快速检测，赶紧开始研究起来

niwanmao

瞄了一些今天的动态，发现都说解释了为什么吃辣椒会头痛、肚子痛之类的，实际上这只是直接层面的意义，这项成果不仅解释了感受温度的机制，更深层次的是对治疗上面的启发，例如疼痛、癌症治疗等。

Transient Receptor Potential Vanilloid-1 (TRPV1)蛋白是一种跨膜、非选择性阳离子通道，可被各种刺激活化，包括热、酸性 pH、辣椒素和其他植物来源的香草素，该受体是Julius等人在2001年发现的，就在昨天，Julius等人由此得了诺贝尔医学及生理学奖。

该受体尽管以感染热、辣椒素等伤害性因素而广为人所知，但实际上已在许多癌症中检测到 TRPV1 表达，包括胶质瘤（Contassot, et al.2004a）、乳腺癌（Weber, et al.2016）、前列腺癌（Sánchez, et al.2005）、结肠癌腺癌（Domotor, et al.2005）和胰腺癌（Mergler, et al.2012）。值得注意的是，辣椒素是一种香草素和 TRPV1 激动剂，被发现通过 TRPV1 依赖性和非依赖性机制对许多癌细胞系具有细胞毒性，这提高了可以在治疗上利用 TRPV1 表达的前景。迄今为止，对正常血细胞或血液系统恶性肿瘤中 TRPV1 表达的评估有限（Omari, et al.2017）。已在大鼠血液中性粒细胞（Wang, et al.2005）、小胶质细胞、脑内巨噬细胞（Kim, et al.2006）和人类血液白细胞（Spinsanti, et al.2008；Saunders, et al.2007）中也能检测到 TRPV1。在人类树突细胞 (DC) 中也检测到 TRPV1 蛋白，因为它在 DC 成熟中起作用（Toth, et al.2009），而关于小鼠 DC 中的 TRPV1 蛋白和 mRNA 表达仍存在争议（Connell, et al.2005）。TRPV1 的激活及其在 THP-1 单核细胞迁移和粘附以及 U937 细胞凋亡中的作用（Maccarrone, et al.2000；Himi, et al.2012；Schilling 和 Eder 2009）。在体外用辣椒素处理血液细胞系 THP-1、U266B1 和 U937 会导致细胞凋亡（Omari, et al.2016）。

由于TRPV1 是一种跨膜蛋白，并且现在有商品化抗TRPV1抗体，所以流式细胞术是非常理想的检测方法。然而，之前使用流式细胞术分析 TRPV1 表达的研究阴性或同型对照关注不够，或者在使用靶向细胞内抗原的抗体时有些文献忽略破膜步骤（Caprodossi, et al.2011a；Huang, et al.2010；Amantini, et al.2004 ；Amantini, et al.2007；Amantini, et al.2009）。故需要有一个优化的方案。

步骤
1. 取100ul样本，加入能够区分细胞群体的表面标记，避光、室温孵育10分钟。
2. 加入红细胞裂解液，避光裂解10分钟。
3. 350g离心5分钟，然后用PBSA（PBS+10％FBS+0.1叠氮钠）洗涤两次。
4. 用商品化固定/破膜剂，进行固定和破膜，接着进行阻断15分钟（破膜缓冲液中加入10％AB型血清、1％BSA、0.05％叠氮钠）。
5. 与0.5ug rabbit polyclonal anti-TRPV1 (Lifespan Biosciences)，4度避光孵育45分钟。另一管同型对照，其它几步完全相同，就这一步用0.5ug同型对照孵育。
6. PBSA洗涤后，加入二抗（1:25），4度避光孵育20分钟。
7. PBSA洗涤两次，PBS重悬，上机检测。

结果展示
目前市场上有三家商品化的TRPV1抗体，但从实验效果来看，只有Lifespan Biosciences的LS-C150735货号，可以在几种恶性血液肿瘤细胞株中检测到明显的分群。下图就是用LSC150735 在 THP-1、U266B1、U937 细胞和健康人淋巴细胞中的检测结果，可见TRPV1信号能与同型对照明显分群：


以血液系统恶性肿瘤患者为例，其TRPV1表达水平较健康对照 (n=20) 有上调（P=0.0351，非配对 t 检验）。 细分的话，B-NHL 患者的 TRPV1 显著高于对照（P=0.0294，Dunnet 检验），不过初发和化疗后的患者，其TRPV1表达水平与对照无统计学差异：



信源：Sofia A Omari, et al.Optimized Flow Cytometric Detection of Transient Receptor Potential Vanilloid-1 (TRPV1) in Human Hematological Malignancies. medRxiv 2021.08.04.21261521; doi: https://doi.org/10.1101/2021.08.04.21261521

小能手

请问实验流程中PBSA的作用是什么？

niwanmao

小能手 发表于 2021-10-8 09:16
请问实验流程中PBSA的作用是什么？

常规实验流程中，都可以用，一方面对细胞活力有好处，其次，能够一定程度上减少非特异性背景。

小能手

niwanmao 发表于 2021-10-8 14:05
常规实验流程中，都可以用，一方面对细胞活力有好处，其次，能够一定程度上减少非特异性背景。 ...

这么说，PBSA可以在除细胞凋亡检测外的常规流式检测中替代PBS，尤其是TIL的检测

niwanmao

小能手 发表于 2021-10-9 09:10
这么说，PBSA可以在除细胞凋亡检测外的常规流式检测中替代PBS，尤其是TIL的检测 ...

对于细胞容易死亡的标本，用PBSA或许可以改善，但最重要的还是标本处理手法上。

小能手

niwanmao 发表于 2021-10-9 13:53
对于细胞容易死亡的标本，用PBSA或许可以改善，但最重要的还是标本处理手法上。 ...

谢谢倪老师的解答，我还想一下，和FACS液相比，PBSC在降低非特性染色有更好的效果，但在降低细胞死亡率上效果差不多，对吗？

niwanmao

小能手 发表于 2021-10-11 12:34
谢谢倪老师的解答，我还想一下，和FACS液相比，PBSC在降低非特性染色有更好的效果，但在降低细胞死亡率上 ...

我不知道你指的FACS液是哪个？是什么成份？ 重要的是成份里面有没有相关保护的东西在里面。

小能手

niwanmao 发表于 2021-10-11 12:50
我不知道你指的FACS液是哪个？是什么成份？ 重要的是成份里面有没有相关保护的东西在里面。 ...

是PBS加FBS

niwanmao

小能手 发表于 2021-10-11 13:58
是PBS加FBS

那是一样的呀，就是少了防腐剂，容易长菌。

小能手

niwanmao 发表于 2021-10-11 16:31
那是一样的呀，就是少了防腐剂，容易长菌。

哦，我明白了，谢谢倪老师