做T细胞增殖，用的CellTrace™ Violet但是同时染了Bv421CD25分析？

Evangeline111

小伙伴们大家好！ 求助：做T细胞增殖，用的CellTrace™ Violet（BV421）但是同时染了Bv421-CD25，标本比较珍贵，请问大佬们最后还有可能分析出增殖峰出来吗？呜呜，多么痛的领悟，实验小白的艰难

wxd

如果CD25的荧光标签强度比初代CellTrace™ Violet标记的T细胞荧光强度强很多，是两个峰的话，是可以看到增殖峰的；或者CD25的荧光分布是一个细长的峰或者表达CD25的细胞量很低，无法掩盖CellTrace™ Violet全部的增殖峰的话，也是可以看到增殖峰的。当然如果你的CD25抗体失效或者没染上的话，也是可以看到增殖峰的。
我想楼主问这个问题的意思是还有没有必要开展后续实验吧。如果楼主第一次进行这个实验，并且实验已经开始了，就用流式细胞仪检测一下吧。这次主要熟悉一下实验的整个流程，毕竟流式检测能不能成功，除了实验方案设计以外，和染色、上机检测也有关系，毕竟样品比较珍贵，得不到实验数据，学习一下经验也好。如果楼主实在担心实验失败或者流式检测已经不方便展开的话，也可以把后续实验换成别的，比如收集上清用ELISA检测上清中细胞因子的浓度变化；收集细胞提取RNA做荧光定量PCR或者提取蛋白做WB，也不算浪费样品。

niwanmao

啊，这是让大家预测吗？

如果感觉没有把握，为什么不先在容易拿到的普通全血样本上尝试呢？把条件摸索建立完善了，再用在珍贵样本上。你说呢？

Evangeline111

wxd 发表于 2023-1-10 09:30
如果CD25的荧光标签强度比初代CellTrace™ Violet标记的T细胞荧光强度强很多，是两个峰的话，是可以看到增 ...

谢谢老师们，分析的很细致，我是在做Treg和naiveT共培养，应该是没有增殖起来（显微镜下没有成团，流式也没有明显增殖峰），加入CD3工作浓度0.3ug/ml，和骨髓来源诱导的DC 6天（CD11c流式检测几乎没有）。其实还有疑问原则上T细胞的活化是需要CD3、CD28、IL2的，但是为什么师姐们做的只加CD3、CD28也能让naiveT增殖成为responder呢？

Evangeline111

niwanmao 发表于 2023-1-9 07:35
啊，这是让大家预测吗？

如果感觉没有把握，为什么不先在容易拿到的普通全血样本上尝试呢？把条件摸索建立 ...

是的，老师说的很对，我下次先在PBMC上预实验了来

wfjprs

您好，我想请教下楼主是用什么试剂刺激T细胞增殖的？

Evangeline111

CD3/28beads或者CD3包被，加CD28抗体，两者我试过都可以，平地板和圆底板都可以

wfjprs

Evangeline111 发表于 2023-6-16 14:29
CD3/28beads或者CD3包被，加CD28抗体，两者我试过都可以，平地板和圆底板都可以 ...

CD3/CD28beads用的哪款能推荐下吗

wanxgq

wfjprs 发表于 2023-7-6 14:52
CD3/CD28beads用的哪款能推荐下吗

我用过CD3/28的偶联磁珠，Invitrogen

wfjprs

wanxgq 发表于 2023-7-6 17:48
我用过CD3/28的偶联磁珠，Invitrogen

用起来效果怎么样？有什么需要注意的点吗