CD107a染色是否必须monensin？

yunshuizhixi

      最近在做CD107A 染色，我的处理方法是将T细胞与靶细胞共培养的同时加入CD107A抗体（BD公司），同时在培养体系中加入BFA（2ug/ml-10ug/ml），处理6-8小时后再标记CD3等抗原。但是结果与阴性对照（单独的T细胞）没有区别，因为我同时收上清检测细胞因子，所以可以确定T细胞受到刺激，而按照文献中介绍T细胞被刺激6小时后CD107A的表达会很明显。之前有怀疑过BFA的问题，但是有同事用相同的试剂和浓度处理PHA刺激的PBMC检测胞内细胞因子的表达结果很漂亮，所以可以排除BFA的问题。查阅了一些文献，大部分文献中都使用了monensin或者monensin和BFA同时作用，介绍说monensin可以调节溶酶体PH帮助CD107A与抗体的结合，所以我们重新订购了一批monensin但目前还没到货，同时最近BD公司的事情让我们也怀疑抗体的有效性，所以想问问有经验的朋友们，单独使用BFA作为分泌阻断剂能否染出CD107A？

niwanmao

应该还是需要的，你看《Alter G, Malenfant JM, Altfeld M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 2004 Nov;294(1-2):15-22.》里面的方法学部分的描述：
While brefeldin A prevents the exocytosis of cytokine containing vesicles allowing for the visualization of cytokine production following stimulation, monensin prevents the acidification of endocytic vesicles avoiding the degradation of reinternalized CD107a proteins from the surface and allowing for the visualization of this marker following stimulation.

flyer625

倪老师，这个文献有原文吗？正常人NK细胞和靶细胞混匀后的CD107a的表达范围大约是多少？急求，谢谢~

yxzxlmlf

flyer625 发表于 2018-8-15 09:46
倪老师，这个文献有原文吗？正常人NK细胞和靶细胞混匀后的CD107a的表达范围大约是多少？急求，谢谢~ ...

你点开链接不就是原文了么？下载不了用sci-hub

ljpshzu

niwanmao 发表于 2017-6-15 19:33
应该还是需要的，你看《Alter G, Malenfant JM, Altfeld M. CD107a as a functional marker for the identi ...

倪老师，在用CART跟靶细胞1：1共培养四个小时，流式检测CD107a，发现加莫奈菌素和不加的组结果很接近。也尝试了其他比例后进行共培养，发现也是一样的。也看到很多文献上检测107a需要加这个试剂，这是什么原因呢？

ljpshzu

不知道你的问题解决了吗，我是用CART和靶细胞共培养，结果发现CD107a结果加不加莫奈菌素都是一样的

niwanmao

ljpshzu 发表于 2021-3-20 23:41
不知道你的问题解决了吗，我是用CART和靶细胞共培养，结果发现CD107a结果加不加莫奈菌素都是一样的 ...

因为你这个实验中，靶细胞其实就是刺激源了，所以体现不出差异。
常规实验中，如果没有刺激源，可能CD107a很难检测出。

ljpshzu

niwanmao 发表于 2021-3-21 12:54
因为你这个实验中，靶细胞其实就是刺激源了，所以体现不出差异。
常规实验中，如果没有刺激源，可能CD107 ...

那没有靶细胞的实验组中，没有了靶细胞的刺激，CART也无法分泌相应因子，即使加入了莫奈菌素也检测不出来。另外一些文献中，也是在将目的细胞和对应靶细胞孵育过程中加入了这个试剂，然后再去检测CD107a的表达。所以这个莫奈菌素的作用到底是什么呢

niwanmao

ljpshzu 发表于 2021-3-21 21:32
那没有靶细胞的实验组中，没有了靶细胞的刺激，CART也无法分泌相应因子，即使加入了莫奈菌素也检测不出来 ...

莫能霉素就是将蛋白阻断在细胞内。

ljpshzu

niwanmao 发表于 2021-3-22 08:50
莫能霉素就是将蛋白阻断在细胞内。

我检测的膜表面表达的CD107a，在加和不加莫能菌素的组中都检测到CD107a的高表达（与靶细胞共培养）。所以它阻断的不是分泌的CD107a，那他是将什么蛋白阻断在细胞内的呢