小鼠外周血流式问题请教，求指点谢谢

wsjheaven

大家好，我最近小鼠外周血液样品做了一次流式。

我制备样品方法：取100ul血液，采用ebioscience的1X红细胞裂解液2ml后避光孵育10分钟，加6ml PBS终止离心后，staining buffer加至5ml洗两次，再上样跑流式。

作为小白，因为第一次做，所以没有染色，但结果有些奇怪，有一些问题请教，谢谢。
1. 无法根据FSC和SSC区分出淋巴细胞，粒细胞，单核细胞。
2. 我看到可以通过FSC-A和FSC-H 排除细胞粘连。我的区域b的细胞，H显示不论A怎么变化都是不变的，所以这部分都是粘连吗？我本来以为通过这部分显示的是不同种类的细胞；其次但是这部分细胞的SSC-A和SSC-H是线性关系，我不太懂SSC-A和SSC-H的关系是否有什么用途，所以想说这跟FSC-A和FSC-H的相互关系结果矛盾。
3.请各位老师提提意见，我应该如何改进或者我的问题在哪？

烦请各位老师指点，谢谢！

niwanmao

你这个电压是否合适？总感觉是不是偏大？

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-9 08:54
你这个电压是否合适？总感觉是不是偏大？

倪老师，想问一下：1.您说我的细胞分群看不出来是因为电压调节的原因吗？ 2.因为我这个没有染色，只有fsc和ssc电压的调节，关于这个电压的调节，其实就是将细胞设置在合适的位置吗？我用的是这个软件，其实就是这个图上的软件中对gain的设置吗？
3. 我这个感觉细胞碎片感觉很多，可能是因为裂解的问题吗？还是流式中设置的问题？

感谢倪老师了

niwanmao

wsjheaven 发表于 2020-11-10 14:07
倪老师，想问一下：1.您说我的细胞分群看不出来是因为电压调节的原因吗？ 2.因为我这个没有染色，只有fsc ...

首先确保红细胞裂解干净，然后再将电压调节好。

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-10 19:50
首先确保红细胞裂解干净，然后再将电压调节好。

好的，我再试试，谢谢倪老师了

liuruiluna

而且染了抗体就会更清楚知道了，能知道哪一群是淋巴细胞群，就知道是不是FSC电压太高，而把残留红细胞和碎片放的太大

wsjheaven

我又重新做了小鼠血的流式，电压也调低了，我自己进行了单细胞设门，然后分群，但是感觉单核细胞和粒细胞是不是有点多？想请教一下，我这个分群合适吗？或者还需要哪方面设置调整，比如电压等。
谢谢各位了。