贴壁细胞线粒体JC-1检测，关于染色时机的选择疑惑

zxt2009

贴壁细胞线粒体JC-10（OR JC-1)检测，关于染色方法的选择疑惑，敬请各位老师、同道解惑、讨论。
研究背景：小弟目前进行肾脏贴壁细胞HK-2的损伤模型研究，前期已经进行过JC-10染色的显微镜观察，染色效果不错。目前还需要进行JC-10线粒体染色的定量分析，遂选择流式方法。
方法：
①参考论坛倪老师发表的帖子：《[流式protocol] JC-1检测凋亡细胞》。染色步骤：染色→清洗→消化→终止消化→离心→PBS重悬→再上机
②根据试剂说明书进行：消化→终止消化→染色→清洗第一次→离心→清洗第二次→离心→PBS重悬→上机

这两种方法，小弟有3个疑问
A. 就方法来说，是不是第一种更好？因为离心次数少了，能减少离心带来的细胞数量丢失、减少离心带来对细胞的损伤，更好的还原细胞贴壁过程中线粒体膜电位情况？
B. 第一种方法中，在已经染色的情况下，进行消化，是否会导致线粒体膜电位出现显著变化，进而使得结果出现明显改变呢？如何更好的预防？
C. 在流式检测中，因为流式检测更敏感，与显微镜下相比，是否应该减少JC-10 (OR JC-1）工作液浓度？

希望各位老师不吝赐教，也欢迎同道各抒己见，感谢！

niwanmao

如果试剂配套说明是这样，就先按试剂说明书做吧。