从自发荧光的小鼠中分离细胞，细胞状态不好

ziniu9572

如题，最近在做一个流式分选的实验，实验目的是从自发荧光的小鼠脑组织中分离带有FITC信号的细胞，但是实验结果很不理想

这是脑组织冰冻切片，共聚焦下能看到明显的绿色荧光，信号很强，但是我把组织制备成单细胞悬液上机之后却没能看到很明显的FITC信号，甚至和阴性对照没有什么差别

                               
登录/注册后可看大图

                               
登录/注册后可看大图

做了DAPI的染色，感觉细胞死亡率也很低

                               
登录/注册后可看大图

我做了好几次都是这样的结果 ，镜下看细胞的状态，皱缩的厉害，然后荧光显微镜下只能看到DAPI的信号，没有FITC信号，我在想是不是我的消化方案有问题，影响了细胞状态这种情况下，我还要尝试继续使用流式分选做吗

niwanmao

有几个疑问：
1、DAPI能在BV421通道检测到？我看波长似乎是紫外激光，而BV421是紫光激发，并非紫外激发。
2、荧光显微镜下的绿色荧光信号，如果确认是真实的细胞，那么是否在解离为单细胞的过程中，被处理碎了？

ziniu9572

niwanmao 发表于 2022-3-25 13:23
有几个疑问：
1、DAPI能在BV421通道检测到？我看波长似乎是紫外激光，而BV421是紫光激发，并非紫外激发。
2 ...

我用的是分选型流式细胞仪BD Aria FUSION， 405激发(BV421）,检测的灵敏度很高，应该不是紫外激光。然后绿色荧光和细胞核染色是完全重合的，肯定是细胞 ，而且我可以分选出和绿色荧光共定位的细胞，但是一直得不到FITC的信号。我怀疑是 我的细胞状态改变导致和GFP偶联的蛋白被降解，所以信号没了。单细胞悬液放到计数板上，显微镜下也找不到绿色的荧光。

liuruiluna

DAPI用UV会激发得更强，用405可以激发一些些，又因为dapi亮度特别高，所以用405激发也能看到信号。如果分选的细胞在分选前，状态很好，分选后状态不好了，可以在分选和收集过程的条件进行优化。比如缩短分选时间，或者如果分选速度过高，液路里的压力也会损伤细胞。 另外就是收集管中可以提高营养条件，比如用培养液+10-20%的FBS。 如果分选前状态就不好，那就还要对样本处理的步骤需要优化，比如消化时间，用的消化酶的配方优化