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[细胞增殖] CFSE染色后立即上机出现双峰的问题

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 楼主| 发表于 2022-9-22 18:27:09 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 XYT 于 2022-9-25 13:46 编辑

请问一下各位老师,我做的人外周血淋巴细胞CFSE染色,用0.1%BSA-PBS重悬细胞,调整细胞浓度为2×10^6/ml,加入0.5ulCFSE(终浓度为2.5uM),37℃温育10分钟,每2分钟晃动一次细胞,加入预冷的5倍体积完全培养液5min,再洗涤1次,用1ml室温完全培养液重悬细胞后马上上机,得到的结果显示CFSE为双峰,不知道是什么原因等导致,CFSE没染上?

染CFSE立即上机

染CFSE立即上机

染CFSE加PHA刺激后培养3天后上机

染CFSE加PHA刺激后培养3天后上机
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CFSE 1.25uM

CFSE 1.25uM

CFSE 2.5uM

CFSE 2.5uM

CFSE 5uM

CFSE 5uM

CFSE 10uM

CFSE 10uM
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发表于 2022-9-22 19:36:02 | 显示全部楼层
终浓度2.5是不是太低了?导致染色不均匀?
试一下5看看
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 楼主| 发表于 2022-9-22 19:43:24 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-9-22 19:36
终浓度2.5是不是太低了?导致染色不均匀?
试一下5看看

老师好,上次做实验用的5uM(不过染的细胞数是4×10^6左右),也是分了两群。那我应该试一试1×10^6/ml用5uM浓度?【担心CFSE细胞毒性所以设置浓度相对低】
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发表于 2022-9-22 19:51:43 | 显示全部楼层
XYT 发表于 2022-9-22 19:43
老师好,上次做实验用的5uM(不过染的细胞数是4×10^6左右),也是分了两群。那我应该试一试1×10^6/ml用 ...

可以做一个浓度梯度。

另外,建议看一下FSC和SSC散点图,是否圈进了细胞碎片或噪音信号?
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 楼主| 发表于 2022-9-22 23:15:54 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-9-22 19:51
可以做一个浓度梯度。

另外,建议看一下FSC和SSC散点图,是否圈进了细胞碎片或噪音信号? ...

好的,已上传到帖子里,应该还好?
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发表于 2022-9-23 09:12:27 | 显示全部楼层
XYT 发表于 2022-9-22 23:15
好的,已上传到帖子里,应该还好?

先做浓度梯度看看吧。
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 楼主| 发表于 2022-9-23 09:35:01 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-9-23 09:12
先做浓度梯度看看吧。

嗯嗯,好的,谢谢老师~
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 楼主| 发表于 2022-9-25 13:49:41 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-9-23 09:12
先做浓度梯度看看吧。

老师您好,我上传了CFSE浓度梯度1.25uM、2.5uM、5uM、10uM,我发现第一个圈门圈靠右一点结果相对好些,不知道这样靠谱不,后3个浓度梯度貌似差异不大。
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发表于 2022-9-25 14:57:02 | 显示全部楼层
XYT 发表于 2022-9-25 13:49
老师您好,我上传了CFSE浓度梯度1.25uM、2.5uM、5uM、10uM,我发现第一个圈门圈靠右一点结果相对好些,不 ...

5开始就没问题了,可以用5uM

只是是不是红细胞裂解的问题,FSC/SSC没分开,这样比较容易影响设门,可增加一个特异性标记去掉红细胞和碎片。
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