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为什么要用CD107a来评估NK杀伤功能?做的时候有哪17个要点?

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发表于 2023-11-19 19:57:05 | 显示全部楼层 |阅读模式

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自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK)是在固有免疫应答中起核心作用的一类免疫细胞,能够消灭正常的应激细胞,如病毒感染细胞和恶性转化细胞。

NK细胞的活性受到通过激活和抑制受体在其表面表达的信号转导的紧密平衡的调节,与T细胞不同,NK细胞的激活不需要事先抗原启动。在这一系列调节受体中,NKG2D作为调节NK细胞功能的关键受体脱颖而出。在人类中,NKG2D配体包括应激调节分子,如MHC I类多肽相关序列A/B (MICA/B)和UL16结合蛋白(ULBP)分子,这些分子在肿瘤细胞表面过表达。

NK细胞主要是细胞溶解性免疫细胞,其主要作用机制依赖于一个称为脱颗粒的过程。NK细胞在其细胞质中含有预先形成的含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒,这些颗粒在靶细胞识别后将其内容物释放到免疫突触中,导致靶细胞的裂解而不影响免疫效应细胞。

溶酶体相关膜蛋白-1 (CD107a或LAMP-1)是存在于溶酶体中的高度糖基化的跨膜蛋白。在NK细胞和细胞毒性T细胞中,CD107a是细胞毒颗粒中最丰富的蛋白质之一。这种分子位于囊泡的膜上,将其高度糖基化的部分隐藏在管腔一侧,并将其短尾暴露在细胞质上。脱颗粒时,颗粒的外膜与NK细胞的质膜合并,导致CD107a分子的表面暴露,这被认为是保护效应细胞免受脱粒相关自杀的机制。

CD107a膜表达已被广泛描述为活化的细胞毒性淋巴细胞的标志,包括CD8 + T细胞和NK细胞。流式细胞术分析评估的CD107a表面表达率与NK细胞的细胞毒活性、细胞因子分泌之间存在直接相关性,故成为评估免疫细胞对各种刺激(包括肿瘤细胞)的细胞毒反应的可靠方法。

CD107b/LAMP-2和CD63/LAMP-3这两种与CD107a属于同一家族的蛋白也存在于NK细胞和细胞毒性T细胞的细胞毒颗粒中。与CD107a相比,CD107b表面暴露较少,CD63膜表达与NK细胞的活化没有明显的相关性,所以这两个分子无法衡量NK细胞脱颗粒水平。

通过检测表面CD107a来测量NK细胞的活化与其他方法相比有几个优点。最重要的是,这种方法提供了关于效应群体的直接信息,而细胞毒性试验只检测目标细胞的最终裂解能力。此外,CD107a的标记可以根据NK细胞的活化水平来区分多个NK细胞亚群。

然而,该试验应与NK细胞毒功能和/或细胞因子产生试验相补充,以便更深入地了解针对特定刺激的免疫机制。

流式细胞术检测NK细胞中CD107a表面表达的体外脱颗粒试验的方案,简单来说,需将K562(细胞密度10E6/ml)和PBMC(细胞密度10E7/ml)各100ul加入96孔板,总共200ul体积中,两者效靶比为10:1,接着每孔加入10ul CD107a抗体,37℃孵育4小时(其中在孵育1小时的时候,将2ul GolgiStop加到75ul完全培养基中,混合均匀后,每孔加入5ul,充分混匀)。4小时后,开始染CD3、CD56等抗体,进行检测。

实验中,可设置3个组,分别为基础脱颗粒水平组、共孵育组、阳性对照组,如下图设置:
2023-11-16_16.32.02@2x.png

最终流式图如下,IgG和NKG2D分别是实验中加入的干扰措施,IgG是无效干扰,NKG2D抗体可阻断一部分NK细胞毒作用:
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