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使用串联染料的注意事项和诀窍

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发表于 2015-7-8 20:37:24 | 显示全部楼层 |阅读模式

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上周《串联染料真的毫无是处?就那么受人歧视吗?》(http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4518-1-1.html),澄清了大家对串联染料的一点误会。在帖子中,有FLOWER提出了,如何避免降解,如何检查发生了降解?
这确实是个问题,所以我们得认真回答一下。

有关串联染料的重要说明
1. 串联染料是利用FRET(能量转移)实现受体荧光分子的激发,但其效率不可能达到100%,所以会有一些供体荧光分子的渗漏。例如PE-cy7荧光分子,即使不降解,也可能会有少量PE荧光渗漏,不过一般情况下荧光分子质量好的话,可以忽略。但仍需时常记得用同型对照和串联染料单染标本调节补偿。
2. 串联染料容易发生所谓的“降解”,意味着受体荧光分子发光减弱或丢失,而供体荧光分子发光增加。因为串联染料是共价键连接的,所以供体荧光分子和受体荧光分子不会完全分离,之所以无法继续进行FRET,原因可能有两种:一是受到光照导致供体和受体荧光分子均发生淬灭,二是氧自由基破坏了受体荧光分子。无论哪种均可造成串联染料不可逆破坏。
3. 在多色流式中使用串联染料,切记要使用同型对照确定背景荧光,使用单染管调节补偿,使用FMO(Fluorescence minus one)对照设门。


正确使用串联染料的诀窍
1. 避光,并且避免温度过大波动(4℃避光)。
光会使荧光分子淬灭大家都很清楚,但是温度可能很多人不会去注意,切记不要将串联染料抗体冷冻。
2. 避免“过度固定”。
串联染料固定时间不要超过30分钟,及时进行洗涤重悬。
3. 需注意在多色流式时受体荧光分子被不同激发光激发的可能。
例如 PE-cy5串联染料中的受体荧光分子Cy5既可被蓝光先激发PE分子再通过FRET作用激发,也可被红光直接激发,所以在和APC染料合用时要注意,不过可以通过补偿调节排除。
4. 在4℃或冰上标记细胞。
APC串联染料稳定性偏差,容易受细胞代谢影响,所以利用低温降低细胞代谢可提高这类串联染料的稳定性。
注:本文译自Biolegend网站 http://www.biolegend.com/tandem_dyes
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发表于 2015-7-9 13:50:21 | 显示全部楼层
非常好的资料,学习了~
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发表于 2015-7-21 08:49:28 | 显示全部楼层
挺受用,在使用串联染料时就知道该如何处理了。
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发表于 2019-10-25 14:45:52 | 显示全部楼层
倪老师,有一个问题,关于FRET荧光共振能量转移的,PE-Cy7,和APC-Cy7,都是串联染料,APC的发射光谱大概在600-750,波峰在660位置,而Cy7的激发波峰在710,两个之间有重叠的,而且660也接近710了,可以能量转移及这个效率我能理解,但是PE-Cy7咋回事,发射光谱大概在525-725之间,虽然也有重叠,但是这个PE波峰在575的位置,离710也太远了。
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 楼主| 发表于 2019-10-27 20:13:05 | 显示全部楼层
特勒兮兮 发表于 2019-10-25 14:45
倪老师,有一个问题,关于FRET荧光共振能量转移的,PE-Cy7,和APC-Cy7,都是串联染料,APC的发射光谱大概在 ...

发生共振能量转移的其中机制,可以肯定的是不单纯是波长,还涉及到一定的距离引起的能量转移。这已经超出我们的能力范围了。
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