免疫分型临床流式质控手册，附流式中文网点评

niwanmao

10月底，开了第三届中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组委员会议，讨论的重点就提到了质控。质控这个东西大家都知道很重要，但是确实很难去全方面实施，会上初步决定先从仪器质控开始。
但是，整体的质控，迟早需要实施，因此在此给大家介绍这篇2000年发表在Journal of Immunological Methods上的综述性文章，虽然时隔久远，仪器更新很快，但内容并没有过时。

只是我们在编译过程中，感觉整体都是以文档存档以便追溯为出发点设计，如果完全遵循此文档，对临床工作有较大影响，尤其是工作量大的地方，但不管如何，这个手册是一个非常完整的框架，你即使每步学到了点皮毛，对你的免疫分型项目管理、质量提升都是非常有帮助的。

文章的目的是讨论验证和质量控制，特别是在血液病理学方面。虽然本文涵盖了适用于美国的监管问题，但世界各地的所有实验室都还是需要这。良好实验室规范包括标准操作程序（SOP）、质量控制（QC）和质量保证（QA），这是提供正确诊断结果的必要条件。无论厂家提供的体外诊断（IVD）试剂的要求如何，每个实验室都应验证试剂的灵敏度、特异性以及与形态学和临床发现的相关性。

全面质控分成实验室职责、试剂和仪器验证、质量控制、质量保证和故障排除等内容，全面做好流式质控，将其作为将新技术整合到诊断血液病理学中。

一、实验室职责
在美国，流式细胞仪属于高复杂性实验室测试下面的疾病控制和预防中心（CDC）类别，在这个类别中，需要提供员工资格和培训的文档记录，以及分析准确性、灵敏度、精确度和质量控制的记录。在某些州，如加利福尼亚州，负责撰写流式细胞仪结果的人员必须是获得许可的医疗技术人员，他们每年需要接受12小时的继续教育。其他州可能没有相同的人员资格，但至少，必须记录技术的培训和熟练程度。实验室应制定培训SOP，并由主管核实每位员工的履行职责的熟练程度。仪器制造商和科学协会也开展培训课程并提供培训证书。此外，美国临床病理学会（ASCP）为流式细胞仪的国家认证提供专业考试（QCYM）。

1、能力验证
所有高度复杂的实验室必须参加符合CLIA规定的能力验证（PT）计划（Subpart I）并经健康与人类服务部（HHS）批准。 法规要求实验室告知HHS将使用哪些程序，列出为每个程序执行的测试，在选择不同程序之前参与计划至少一年，并且必须在更改之前通知HHS。 实验室还必须授权PT计划向HHS发布数据。
能力验证样本必须采用与患者样本相同的工作流程、相同的处理方式、相同的实验人员，结果不得与其他实验室讨论，PT样本在任何情况下都不得外包，必须保留有关PT样品处理、制备、加工、分析和解释的文件，最终报告必须保留至少2年。

2、样本处理
所有实验室必须确定样品要求、建议的运输条件和可接受性标准。 处理、包装、标记和运输潜在传染性生物标本的程序之前已经公布（Nicholson等，1994; National Committee for Clinical Laboratory Standards，1990,1997a）。 美国-加拿大共识强烈建议尽一切努力从任何提交用于白血病或淋巴瘤免疫分型的标本中获得有用的信息（Stelzer等，1997）。 要求医生始终了解样品质量问题; 任何经过评估的样品，无论是否评估，都必须在试验解释中加以说明。
临床样本必须提供一定的信息 - 至少应该有唯一的患者标识符、测试顺序和采样日期，其他有帮助的信息包括初步诊断、年龄、性别、标本采集日期和时间、标本来源、医生姓名以及最近的治疗或药物。 必须确保机密性，并且跟踪样本处理的文档是必不可少的。 只有经过授权的人员要求，才能进行测试。 口头请求必须遵循书面授权。 所有要求必须至少保留2年。

3、样本制备
用于流式细胞术分析的样品制备必须考虑提交的样品类型和可用于分析的细胞数量。 应对外周血、骨髓或组织标本进行处理，使其含有目标细胞的悬浮液，消除红细胞，其浓度最适于单克隆染色（0.5-1×10E7/ml；每管0.1 ml）。 所有处理程序都必须事先编辑被经批准，保持每日记录。 测试记录必须保留至少2年。
Good laboratory practices和CLIA 88要求所有临床测试需要有足够的准确性、特异性、灵敏度和精确度，然而，对于通过流式细胞术进行的白血病和淋巴瘤免疫表型分析，没有针对这些评估的共识标准或建议; 因此，每个实验室必须建立自己的性能标准。

4、准确度
分析准确度，就是将测试结果与参考或金标准进行比较。在血液学中，正常细胞群可以用血细胞计数仪或自动化设备进行显微镜计数，并对结果进行精确比较。但在异常群体中，特别是基于多参数时，比较会变得复杂。对于血液病理学，历史上的金标准是形态学，因此理论上，流式结果必须与形态学相比较。然而，对于罕见事件，形态学诊断很困难，流式细胞术能够区分出复杂表型的细胞群，此时应通过与先前明确的细胞特征进行比较来评估准确性。
先前明确的细胞特征哪里来的呢？一般是三大类：
（1）来自另一个经过验证的实验室的相同诊断的冷冻保存标本
（2）或来自相同诊断病例的复发标本。
（3）或是细胞遗传学和分子生物学诊断相同的病例。
至少对比20个具有完整的组织病理学和临床病史的白血病和淋巴瘤病例，文件存档，以支持分析准确性。
准确性判断中不应忽视的另一方面是用于区分细胞谱系定性描述。dim、moderate和bright三种阳性表达模式，对于诊断和预后都非常关键，故需充分准确定义并记录。当组合使用与不同荧光标记的多种抗体时，应分别评估每种抗体的准确性，并将单个标记时的比例和强度结果，与使用混合抗体时的结果进行比较。

流式中文网觉得，对于这一步，最适合的方式应该是室间比对。

5、特异度
单克隆试剂的特异度由抗体识别正确靶标的程度来定义。厂家有责任确保其试剂具有正确的特异性，而对于实验室，在白血病和淋巴瘤测试中，应将流式结果与形态学和临床表现进行比较，以评估测试的“特异性”。每个实验室应建立自己预期的流式和形态差异率，应< 5％。然后，实验室应根据具体情况评估出现差异的原因，将差异记录为QA评估，并每季度监测趋势。
流式细胞术试剂的特异性可通过共识研讨会、出版物或内部验证来评估。最值得注意的是来自各种人类白细胞分化抗原研讨会的出版物，最新的是Leucocyte Typing VI（Kishimoto等，1997），它恰当而简洁地总结了大部分测试结果（流式中文网注：流式中文网进行了数据整理，手机端，大家可关注流式中文网公众号，点击菜单“CD分子查询”，PC端可直接访问http://www.flowcyto.cn/bbs/cluster.php查询）。
然而，流式细胞仪单克隆试剂被认为是‘home-brew’试剂，每个实验室必须记录染色性能，记录区分正常和异常细胞群、识别阳性和阴性细胞群的“诊断特异性”。 临床免疫分型样本通常都会有异常细胞群，同时也有残留的正常细胞，因此可以挑选一个标本进行评估特异性。

6、灵敏度
试剂灵敏度描述了检测非特异性或阴性染色以上的最小染色强度的能力。 检测的灵敏度取决于单克隆试剂的滴定、正确的仪器设置和校准、计数的细胞数量和仪器的流速。
因此，需要记录试剂滴定和每批新抗体的平行测试，还需要仪器校准及其文档记录。

7、精确度
精确度是标准分析参数，其测量染色的单个样品的结果再现性。一般一式两份分析至少10次，NCCLS指南推荐20个重复测试。可以使用正常的外周血，细胞系、血液标准品，应记录每种单克隆抗体的定量平均值和标准偏差，并记录2 S.D. 范围。通过将相同的染色样品运行至少三次来完成仪器精确度的确定，结果在2 S.D.内。

二、免疫分型验证
实验室如何验证流式细胞免疫表型？ 基本组成部分是验证输出报告解读的三个组成部分：仪器、单个试剂和染色方案。

1、仪器性能验证
仪器性能验证分为两个方面：
（a）仪器设置，光散射和荧光测量的日常鉴定。
NCCLS建议流式细胞仪的设置足够仔细，以确保正确的光路校准从而获得足够的光散射和荧光灵敏度和分辨率，在使用多种荧光染料时荧光补偿设置需正确。 虽然硬件配置可能不允许实验室对光学器件进行校准，但实验室必须对性能进行检查并记录。 此外，由于不同制造商制造的流式细胞仪的硬件和光学不同，推荐的仪器设置和性能质控程序会有所不同，可按照厂家推荐进行。
FSC和SSC光路校准采用大小一致的Beads，使Beads落在大多数临床样品观察到的光散射范围内，每天在恒定的PMT电压下，记录平均FSc和SSc通道数和百分比变异系数（％CV）。首先在相同的PMT设置下，5天内跑Beads20次，建立每个参数的可接受范围，然后使用Levy-Jennings图来绘制每日获得的值，并建立行动计划，以便在任何参数超出预期范围时做什么。然而，由于珠子和细胞在流式细胞仪上的表现并不总是相似，因此建议使用生物材料设置仪器后，再跑一下临床样品，并在日常仪器鉴定中确定不同细胞类型的正确分辨率。
荧光灵敏度和分辨率的质控范围可以通过两种方法建立：（a）以预设固定激光功率、滤光片、PMT电压和增益，记录校准微球的平均荧光强度值和CV。（b）每次将校准微球定位在同一个位置所需的电压和增益。 任一种方法，均可通过使用5天内至少20个重复数据来建立可接受范围。每当新批次的珠子投入使用时，必须重新建立新的范围。无论使用何种方法，如果测量参数不在可接受范围内，该怎么应对的程序也必须建立、遵循并由临床实验室记录。
至于补偿，需在初始仪器设置时先评估，然后每天进行监测。除了仪器制造商提供的补偿微球外，建议增加生物补偿对照（即真实样本），例如常见的4色仪器比较合适的生物补偿控制包括：正常人外周血淋巴细胞用CD4-FITC、CD8-PE、CD2-PE-Cy5.5和CD45-APC染色。

（b）使用相关临床样本进行跨仪器性能评估。
在多个仪器上做相同临床免疫表型分析方案的实验室应该包括至少五个不同的和具有代表性的临床样品进行半年交叉仪器比较，这些样品用该机型对应的标准方案染色。 每个样本获得的结果在仪器之间的差异不应超过预定义的可接受方差。 应记录此跨仪器样品测试过程，并在交叉比较结果不符合性能规格时建立并遵循纠正措施计划。

2、分析前质控
实验室不仅必须建立免疫表型标本的验收标准，还必须有评估可接受性和登记的程序，以帮助排除故障和解释结果。NCCLS建议在接收样本时进行肉眼观察确认样本质量：溶血、凝血、极端温度和标识错误等均需记录。

3、试剂和方法验证
免疫分型首先需要选择单克隆试剂和荧光染料，这些试剂和荧光染料将用于多参数分析和结果解释。检测方案的设计目的是能够根据光散射和/或荧光强度的差异清楚地区分正常和异常细胞，这个原则对结果的解释是不可或缺的。因此，方案尽可能包括所有相关标记。
美国-加拿大共识会议没有建议用于白血病和淋巴瘤免疫表型分析的具体诊断方案组成，但是对42种决定因素达成了一致，这些决定因素可以提供这些程序的诊断信息（Stewart等，1997）。每个样本必须被视为一个独特的案例，并进行全面评估，以尽量减少任何异常。方案中抗体的选择需要根据费用、鉴别性能等进行综合平衡。因此，委员会不指定应该用哪些抗体，而是将组合的权限留给测试实验室，实验室应根据目标制定适合自己的方案。
所有设计好的组合，必须在实验室中进行验证，分析人员必须熟悉每种组合相关的表达模式。同一CD分子不同克隆号可能表现不同。类似地，用不同荧光染料标记的相同CD分子，也可能显示不同荧光强度和不同的荧光渗漏。
抗体的搭配必须考虑正常和异常细胞以及抗原表达强度，以尽量减少试剂之间的干扰。 对于多种荧光染料组合，实验室不仅必须验证每种单克隆抗体的表现如何，还必须证明其性能不受表位共阻断、荧光猝灭或能量转移的影响。
抗体混合物可以从厂家购买或由实验室制备，无论试剂是以什么形式购买，都必须验证每种混合物的性能并记录失效日期。
自己配制抗体混合物的时候，每种单克隆抗体必须单独滴定，以实现最佳的信噪比分离。然而，某些克隆和/或荧光染料之间的潜在干扰，还需要进行棋盘式滴定，以在组合使用试剂时选择最终的最佳工作稀释度。如果试剂以预混形式储存，则使用适当的对照细胞进行足够的QC程序，以验证预混试剂性能的时间稳定性。验证时，最好的方法是使用单一试剂设置PMT，然后使用预混试剂检查补偿。

4、样本制备
作为分析程序的一部分，实验室必须明确并验证样品制备程序。
红细胞裂解是最常用于制备用于临床免疫表型外周血或骨髓标本的方法。可以在用单克隆抗体染色之前或之后进行裂解。 无论使用哪种红细胞裂解方法，都必须在报告临床结果之前进行验证。 通过观察浑浊的红细胞悬浮液在5到10分钟内变成透明或半透明溶液进行验证。 如果在离心和重悬后仍存在红细胞，则应重复裂解过程。
对于组织样本，应进行解离和过滤，制备成单细胞悬浮液（此处良心推荐一下咱们流式中文网原研耗材，魔滤®＋魔杵，简单快速处理各类组织，物理解离，详见新奇智造网上小店 https://kdt.im/PhQvsr）。 该步骤也必须编写成文档和验证，验证时，应制备组织的细胞学玻片并H＆E染色进行评价和对比，评估某些脆弱细胞（如RS细胞）是否处理时发生丢失。 但纤维化组织中的一些大细胞可能难以过滤，在加工过程中将发生细胞损失。此外，淋巴结中淋巴瘤局灶性分布，容易导致出现假阴性。
单克隆抗体染色结果的可重复性，依赖于细胞与抗体之间比例的一致性。 对于造血免疫表型分析，应对所有标本进行细胞计数，以确保细胞与单克隆抗体的比例正确，从而获得稳定的染色强度。 NCCLS建议根据外周血的WBC计数进行以下调整（对于骨髓没有类似的建议，每个实验室都应该建立并验证自己的程序）：
（a）WBC为1000个/ul：使用200ul全血并适当调节溶血素的量;
（b）WBC为1000-10,000个/ul：使用100ul全血和标准体积的溶血素混合;
（c）WBC为10,000－20,000个/ul：使用50ul全血并适当调整溶血素的量;
（d）WBC>20,000/ul：用PBS稀释全血以达到WBC浓度1000-10,000/ul，然后使用100ul和标准体积的溶血素混合。

5、样本活力
评估活力对于通过流式细胞术评估白血病和淋巴瘤标本至关重要，因为抗原表达需要细胞膜完整性。收集时的活力、运输环境的影响和测试前的时间都会影响样本的活力和肿瘤细胞检测能力。
根据最近的共识建议，当活力低，例如低于30％时，应使用门控鉴别策略将分析限制为活细胞，以最小化死细胞的非特异性结合，避免误诊。
可用几种不同的方法来报告活力：台盼蓝、7-AAD或碘化丙锭（PI）。最常见的是台盼蓝染料拒染法，用血细胞计数器或显微镜观察。

三、染色过程质控
仪器设置和性能验证完成后，运行正常样本染色过程。 为此目的，可用一些商品化的细胞质控品评估。
除了商品化的细胞质控品，还可利用每个白血病或淋巴瘤标本都含有的正常细胞群，作为质控参数。

四、同型对照
对于定量免疫表型分析，常包括同型对照以提供阴性细胞参照以评估每个象限中的细胞数量。然而，白血病和淋巴瘤的免疫表型分析是定性评估，通常不需要象限分析。 此外，由于所有白血病和淋巴瘤都是细胞混合物，那些不表达该抗原的细胞将成为良好的阴性对照。
这里需要说明一点的是，对于IgG类抗体，不同IgG亚类与某些细胞的Fc受体结合不同，通常是IgG2b>IgG2a>IgG1，这种非特异性结合，容易导致假阳性。需要关注。

五、过程质控
如果每个管中存在共同的抗体，则更容易解释荧光表达模式。 例如，CD45可用作多色混合物的每个管中共同标记，提供用于与其他表型模式比较的参考群体。 然而，最重要的参数是基于经验的。 分析师必须了解用于识别异常群体的标记和模式，以正常对照为基准，报告与正常模式的任何偏差，并与其他标记或技术（如细胞遗传学或分子技术）一起确认。

六、数据分析和解读
设门是多参数数据分析中最重要步骤之一。在诊断案例中，应评估所有细胞。美国-加拿大的共识建议初步分析应包括所有活细胞。只有当所有感兴趣的细胞都包含在分析门中时，才能进行下一步分析。具体的设门步骤不做规定。
异常群体的判断需要根据荧光强度，阳性细胞百分比的计算无助于解读。
流式细胞仪数据的解释依赖于经验丰富的诊断解读人员，通常是病理学家，审查包括形态学在内的所有数据，最终给出综合性结论。所有报告必须发送给请求方，并且必须保留至少2年。

终于编译完了，这些资料虽然比较笼统，但不失为国内进行相关工作的参考资料。
流式中文网之前编译了不少质控方面的资料，有兴趣的朋友可继续阅读：
（1）仪器质控——流式检测正确与否的根本因素（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7038-1-1.html）
（2）来自瑞士流式协会的8色质控经验（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6217-1-1.html）
（3）【录像】2014年8月6日临床流式质控讲座（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3737-1-1.html）
（4）多色流式细胞术的详细质控手册（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2628-1-1.html）
（5）2007年的临床流式细胞术质控（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1572-1-1.html）
（6）2007年临床流式细胞术质控的补充（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1573-1-1.html）
如果今天的内容和这些资料对你有帮助，点个赞：）

参考文献：
Marilyn A. Owens, et al.(2000). Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. Journal of Immunological Methods 243 (2000) 33–50

飞哥哥爱你呦

最近就要做这个，收藏了