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#没那么简单的流式#忽略Fc block导致的错误圈门

发布者: zengyikaren | 发布时间: 2019-12-9 00:39| 查看数: 649| 评论数: 0|帖子模式

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  1.同型对照的背景强于特异性抗体的现象

     同型对照被广泛用于非特异性结合的背景对照,因为我们假定同型对照可以和对应的特异性抗体有相同的背景结合(需注意不同厂家的抗体,即便是同样的抗体类型,会表现出不同非特异性结合背景)。然而Morten N. Andersen 等[1]发现,使用anti-Tie2(一种低水平表达于正常人单核细胞的血管生成素受体蛋白)AF647和其同型对照IgG1 AF647(两种抗体来源同样厂家,抗体浓度)对CD14+ 单核细胞的染色,却发现了IgG1 AF647对CD14+单核细胞的结合能力甚至超过了anti-Tie2 AF647,说明了IgG1 AF647同型对照的背景结合能力强于anti-Tie2 AF647。因此这样的流式图结果就会让我们误以为这群CD14+单核细胞上没有Tie2(见图1)

图1.png

图1. Isolated CD14+ cell 对同型对照IgG1 AF647比特异性抗体anti-Tie2 AF647的非特异性结合还要强的结果。

2.通过Fc block 纠正同型对照的非特异性结合

研究者通过Fc block,可以将IgG1 AF647 的非特异性结合降低至unstained tube的水平(见图2 3rd row vs 1st row 第一列)。

图2.png
图2. 通过Fc block可以将CD45+/live/single cell对IgG1, IgG2a的非特异性结合调整至unstained tube水平(注意此处unstain和stain指的是isotype)。


图3.png
图3. Fc block原理示意图[2]3.汇总对比CD3+ T cell, CD14+Monocytes, CD19+Bcell, CD56+NK cell, CD11b+/monocyte-derived macrophages群体对IgG1, IgG2a, IgG2b非特异性结合

最后作者汇总比较了Fc block 对CD3+ T cell, CD14+Monocytes, CD19+B cell, CD56+NK cell,CD11b+/monocyte-derived macrophages群体对IgG1, IgG2a, IgG2b非特异性结合的影响,得出结论:人单核细胞和monocyte-derivedmacrophages对mouse IgG1, IgG2a型蛋白显示出强烈的非特异性结合,但对IgG2b型蛋白结合不明显。然而,人B细胞,T细胞和NK细胞对这三种小鼠源同型蛋白未显示出明显的结合。因此,如果我们实验的分析的细胞属于人Monocytes或者monocyte-derived macrophages,需特别注意Fc block的重要性,警惕仅仅靠同型对照确定圈门可能的错误。


Reference:

[1]Elimination of erroneous results in flowcytometry caused by antibody binding to Fc receptors on human monocytes andmacrophages, Cytometry A. 2016 Nov;89(11):1001-1009. doi: 10.1002/cyto.a.22995.Epub 2016 Oct 12



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