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结合DNA的死活染料,具体怎么用,用多少浓度多少量?

发布者: niwanmao | 发布时间: 2020-4-23 18:53| 查看数: 195| 评论数: 5|帖子模式

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流式检测细胞抗原表达,需排除死细胞,因为死细胞容易粘附抗体,产生大量非特异性信号,造成假阳性,干扰数据分析。这一方面在论坛内写过不少帖子,在此不再赘述。
现在商品化死活染料不少,但是大家可能感觉还是有点贵,所以用DNA结合染料排除死活,是成本相对较低的一个解决方案。
使用DNA结合染料区分死细胞的原理是基于这样的概念,即这些染料是细胞膜不可渗透的,因此不能进入具有完整膜的活细胞。 活细胞将这些染料排除在外,几乎不显示荧光,而染料在死细胞中则畅通无阻,因此荧光能够染上。
但是需要注意的是,随着孵育时间的延长,染料(例如PI和7-AAD)可以被吸收到活细胞中,因此应在分析之前即时添加这些染料(控制10分钟内,一般1~2分钟即可)。
另外一点需要注意的是,DNA结合染料不能用在固定或破膜的细胞上,就是说你做胞内或核内抗原检测的时候,就不能用DNA结合染料区分死活,此时就必须买适合固定/破膜细胞的那些商品化染料。


可用于区分死活的DNA结合染料主要有PI、7-AAD、TO-PRO-3、PY等,具体的浓度、用量、用法如下:
1. 将500μL细胞悬液(1-2×10E6个细胞,保证未固定)添加到流式管中。
2. 加入溶解在PBS中的DNA结合染料,各种染料浓度和用量分别是 PI(5μL,浓度200μg/ mL)、7-AAD(4μL,浓度250μg/ mL)、TO-PRO-3(4μL,浓度250μg/ mL)、PY(5μL,浓度200μg/ mL)。
3. 在冰上孵育细胞至少5分钟。
4. 通过流式细胞仪获取和分析细胞。

结果示例:
11.gif
图片来源:Blizard Institute - Queen Mary University

最新评论

Veblen 发表于 2020-5-2 16:50:16
我记得做cell cycle, PI浓度为50ug/ml,没想到做细胞死活要用到200ug/ml.
niwanmao 发表于 2020-5-2 19:54:45
Veblen 发表于 2020-5-2 16:50
我记得做cell cycle, PI浓度为50ug/ml,没想到做细胞死活要用到200ug/ml.

500ul细胞悬液里面加入5ul,所以终浓度是20ug/ml
Veblen 发表于 2020-5-5 14:26:57
niwanmao 发表于 2020-5-2 19:54
500ul细胞悬液里面加入5ul,所以终浓度是20ug/ml

所以正文说的200ug/ml应该写错了吧
niwanmao 发表于 2020-5-5 20:20:20
Veblen 发表于 2020-5-5 14:26
所以正文说的200ug/ml应该写错了吧

你还是没理解啊,老兄。染液浓度是200,但是5ul加入到500ul细胞之后,最后的终浓度就是20了
Veblen 发表于 2020-5-5 22:03:58
niwanmao 发表于 2020-5-5 20:20
你还是没理解啊,老兄。染液浓度是200,但是5ul加入到500ul细胞之后,最后的终浓度就是20了 ...

理解了,谢谢倪老师

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