多参数流式细胞术是一种强大的工具，可以揭示人类免疫细胞的表型异质性。 当与细胞分选和测序结合使用时，更是能够揭示细胞群中的蛋白质和RNA表达谱，从而导致在健康和疾病环境中发现了许多新的免疫细胞亚群和相关功能。

但是，在常规多参数流式中，在解释流式细胞仪采集或细胞分选的单细胞数据时需要格外小心，分析人外周血单个核细胞（PBMC）时， 可能会存在双细胞复合物“污染”，从而可能会误导对单细胞数据的解释。更麻烦的是，即使你通过我们经典教学中FSC和SSC的粘连体门排除粘连细胞，再加上死活染料排除死细胞，依然无法消除。

2020年5月13日Cytometry A杂志上，Burel JG在相关文章中给我们展示了这么一个图，A图，作者通过常规的FSC/SSC排除掉碎片，FSC-A/FSC-W、SSC-A/SSC-W依次排除粘连细胞，再通过live/dead染料排除死细胞，如此完备的设门措施之下，仍可发现CD3+CD14+的双阳性细胞，这难道是新发现的单核样T吗？那可不得了了。

可是，通过B图对T细胞、单核细胞、CD3+CD14+细胞的RNA测序结果，残酷地证实了，这就是那小部分紧紧粘在一起不肯分离的T细胞-单核细胞，兼具T细胞和单核细胞的RNA表达谱。



为什么实验中这么注意了，设门也这么完善了，还是存在粘连细胞呢？

这类T细胞-单核细胞复合物与标本是否新鲜分离无关，无论PBMC还是新鲜的全血，均存在，并且即使过再久也存在，并且在T细胞和单核细胞接触点存在LFA-1/ICAM-1极化，作者认为，这类细胞复合物可能本身就存在于体内循环中，应该是有着比较重要的生理功能。看到这里，我在想，T细胞和单核、巨噬本来就应该经常交流信息的，这个状态，可能恰好是两者在「聊天」时候吧。

那么，有没有办法设门找出这些粘连细胞，排除掉呢？作者统计了T细胞、单核细胞、粘连细胞之间的FSC、SSC、CD45差异，由于T细胞和单核细胞都表达CD45，所以粘连后，CD45强度会出现比较明显的提高，所以用CD45/SSC设门相对FSC/SSC来说，较好的能够分开这些粘连细胞，但是从B图可以看出，仍然有一半的粘连细胞位于单核细胞区域内，所以说到底，还是没有理想的办法完全去除。


那么，究竟有没有更好的办法呢？
有，但是不是用常规流式，而是用图像流式，利用其中的BrightField参数，再结合常规的死活染料，可以较好的排除掉，但是从下图也明显看出，还是有微量粘连细胞，这时图像流式的优势体现出来了，可以进一步通过图像观察继续排除掉。


除了T细胞和单核细胞，文章说T细胞和B细胞也容易形成粘连。

说了这么多，并不是叫大家放弃常规流式，转而用图像流式，毕竟图象流式价格、速度、通量不如常规流式，而是让大家在解读数据结果、分选单细胞数据解读时，都多一个心眼，尤其是有新发现的时候，想办法借用其它手段进一步证实。科学的严谨性就体现在此。


参考文献：Burel JG, Pomaznoy M, Lindestam Arlehamn CS, et al. The Challenge of Distinguishing Cell-Cell Complexes from Singlet Cells in Non-Imaging Flow Cytometry and Single-Cell Sorting [published online ahead of print, 2020 May 13]. Cytometry A. 2020;10.1002/cyto.a.24027. doi:10.1002/cyto.a.24027