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发布者: 蒸冬薯 | 发布时间: 2020-10-19 15:14| 查看数: 171| 评论数: 11|帖子模式

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一、用Click-iT EdU 1标记细胞
在培养基中加入EdU,以所需的最终浓度混合均匀。建议起始浓度为10Mm.     
阴性染色对照,包括来自同一群体的未用EdU处理的细胞。

二、消化,制备细胞悬液
胰酶消化, 离心,计数后以相同的细胞密度(10^6)置于流式管

三、固定和透膜
1. 用3 mL 1%牛血清白蛋白(BSA) PBS洗涤细胞一次,去除上清液。
2. 在沉淀中加入固定剂(D成分)100 ul,混合均匀。
3. 室温下避光孵育15分钟。
4. 用3 mL 1%牛血清白蛋白(BSA) PBS洗涤细胞,去除上清液。
5. 用1X clickit透膜和洗涤液(E)100ul重悬细胞,混合均匀。孵育细胞15分钟。

四、click-It 反应
1. 通过在去离子水中稀释10倍原液(见第2页)1:10配制1X Click-iT EdU缓冲添加剂(G)。
2. 根据下表准备MIX
3.对每管固定细胞加加入0.5 mLclickit™,混合均匀。注:每种反应混合物的总体积为600ul
4. 将反应混合物在室温下避光孵育30分钟。
5. 用3ml 1X clickit™(E)清洗细胞一次, 离心细胞,去除上清。加入适宜体积E液上机检测。

五、分析
AlexaFluor™ 488 picolyl azide 488 nm
excitationwith a green emission filter (530/30 nm or similar)
希望顺利



最新评论

niwanmao 发表于 2020-10-19 16:10:49
上面的图没传上来。
可以点击你顶楼帖子的「编辑」按钮,进入编辑状态,然后点击工具栏上的图片上传即可。
蒸冬薯 发表于 2020-11-3 19:50:22
单染了BL1通道,R3圈出增殖细胞。

阴性对照

阴性对照

用作对照确定了R3 的下界,请问上限要确定吗?
为什么BL1通道的峰图有后面有上升的趋势?
请老师指导
D.jpg
B.jpg
C.jpg
L.jpg
niwanmao 发表于 2020-11-4 08:23:04
蒸冬薯 发表于 2020-11-3 19:50
单染了BL1通道,R3圈出增殖细胞。

用作对照确定了R3 的下界,请问上限要确定吗?

其实你这里的结果分群非常好,只是这个对照是不正确的,无法反映真实的背景荧光水平,所以本底偏低,最后导致R3的门位置设置错误。
实际上R3的左边应该在倒数第2个10的N次方那里,右侧在极右(超出了坐标轴范围),所以对照组你就不要做了,只要把实验组的BL1电压调低,让阳性峰出来就OK了。
蒸冬薯 发表于 2020-11-4 09:44:21
niwanmao 发表于 2020-11-4 08:23
其实你这里的结果分群非常好,只是这个对照是不正确的,无法反映真实的背景荧光水平,所以本底偏低,最后 ...

明白了,谢谢老师
蒸冬薯 发表于 2020-11-4 10:12:45
老师我想咨询一下,我用flowjo检查样本质量,提示质量一般
我是低速上样,有的时候发现每秒的events相差有点大,上样前也有涡旋震荡,请问是细胞密度不均导致的样本质量不行吗?
蒸冬薯 发表于 2020-11-6 16:20:58
本帖最后由 蒸冬薯 于 2020-11-6 16:22 编辑

我又来了
双峰很明显,可是我不能画出统一的门,加了药物之后阴性与阳性细胞的界限往右偏离的很厉害
[a 微信图片_20201106161229.jpg ttach]20793[/atta 257.jpg ch] 250.jpg 32.jpg 244.jpg








niwanmao 发表于 2020-11-6 18:03:38
蒸冬薯 发表于 2020-11-6 16:20
我又来了
双峰很明显,可是我不能画出统一的门,加了药物之后阴性与阳性细胞的界限往右偏离的很厉害
[attac ...


你加的药是否有背景荧光?
蒸冬薯 发表于 2020-11-6 20:48:38
niwanmao 发表于 2020-11-6 18:03
你加的要是否有背景荧光?

加的药就是普通药物(LPS),咨询了赛默飞的客服,他表示存在这样的问题,也没有好的解决办法,可能原因药物改变了细胞状态,阴性细胞群体整体偏移没有办法用统一一个门比较。他表示有文献是单个样本内根据双峰分析,我感觉这样不太靠谱。
蒸冬薯 发表于 2020-11-6 20:57:33
蒸冬薯 发表于 2020-11-6 20:48
加的药就是普通药物(LPS),咨询了赛默飞的客服,他表示存在这样的问题,也没有好的解决办法,可能原因药 ...

其实也不算药物,是药物作用后换液取的上清,没想到培养基的改变会出现这样的问题
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