流式细胞术是一种对单个悬浮细胞或其他颗粒进行信息丰富的多参数分析的技术，它可以分析和鉴定包含异质细胞群体的样本中的细胞群体。 这项技术已经从使用慢速“Sip-and-Split”的传统低通量技术发展到使用快速“Sip-and-Siff”技术的高通量平台，该技术可以将air-gap分离的样品流直接从平板传送到流式细胞仪，同时保持高通量能力。 “air-gap”技术不仅将每个样品的采样时间缩短至0.5s，还显著降低了每个样品的采样量至低至1μL，并能够对多达1536个孔的平板进行采样。 自动化样品处理机与传统流式细胞仪的集成，结合自动取样技术的新型流式细胞仪的开发，以及允许先进的样品读取规划、实验设计、数据管理和数据分析的软件的开发，以及自动化样品制备系统的利用，使得大量基于平板(96孔、384孔或1536孔格式)的流式应用成为可能。在本综述中我们称之为高通量流式细胞仪(HTFC)。

HTFC因其含量高、速度快、易于研究悬浮细胞和小颗粒等特点，在药物开发和基础研究方面引起了人们的兴趣。 在过去的二十年里，已经有大量发表的研究描述了HTFC的应用。 本文简要综述了HTFC的主要方法和商品化的HTFC系统，重点综述了HTFC在免疫、感染、炎症和癌症等不同疾病领域的应用现状，并讨论了未来的发展方向。

HTFC在免疫相关疾病中的应用
免疫反应是一种生理防御机制，通过对抗病毒、细菌、真菌或寄生虫等诱导的感染来保护身体，在免疫相关疾病中发挥重要作用，并受免疫细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞以及T和B淋巴细胞)的调节。 中性粒细胞、T细胞和B细胞本质上是悬浮细胞，这使得它们非常适合用于HTFC检测，因为流式细胞术是筛选悬浮细胞的最佳技术。 在过去的几年里，有大量的报告描述了HTFC筛查使用96孔、384孔或1536孔的各种免疫细胞来筛选，例如细胞毒T淋巴细胞裂解颗粒的胞吐作用、T细胞分化、Treg稳定性、吞噬作用、中性粒细胞胞外陷阱、细胞表面蛋白谱和T细胞激活。

细胞毒T淋巴细胞(CTLs)是一种独特的淋巴细胞亚群，在杀伤感染、损伤或肿瘤细胞方面发挥着重要作用。 CTL杀伤细胞的机制之一就是含有溶细胞多肽的细胞毒颗粒胞吐作用。 Florian和Zhao等人用人类白血病CTL开发了许多HTFC CTL细胞毒颗粒胞吐筛选免疫抑制剂，原理就是溶酶体膜蛋白(LAMP-1)抗体与分泌出来的细胞毒颗粒结合。 作者开始将其用于96孔板筛选91种化合物，后将升级到384孔并筛选了1200种化合物，再之后，能够以1536孔格板实现对364202种化合物的第三次CTL筛选。 这些逐步改进的测定方法具有通量逐步提高的特点，很好地反映了HTFC技术发展对可筛选化合物数量以及通量之间平衡的影响。

Tregs表达FOXP3，是通过抑制效应T细胞来调节外周自身反应性T淋巴细胞的关键细胞，在控制各种生理和病理学免疫应答（包括炎症）、自身免疫性疾病和癌症中起着重要作用。 Jepras等人报道了使用人PBMC进行流式细胞术筛选，以96孔格式筛选了70,000种化合物，以找出Treg的小分子诱导药物。 乔斯林等人在美国专利No.5,765,877中描述了通过测量FOXP3、CD4和CD25表达来筛选384孔形式的Treg扩增诱导分子的自动化HTFC平台。 在另一份报告中，Ding等人通过检测FOXP3和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA4）的表达来研究Treg表型稳定性，介绍了使用384孔板自动表型流式细胞术筛查人类原代Treg细胞，这种自动化的HTFC平台已实现了每孔仅使用4000 Treg细胞进行表型筛选就能筛选4213种结构多样且具有生物学注释的小分子化合物。 通过该筛选，可以鉴定出G9a和GSK3α/β是FOXP3表达的有效正调节剂，而BET抑制剂是FOXP3和CTLA4表达的负调节剂。

吞噬作用是机体免疫防御的主要机制之一，可吞噬异常颗粒、外来微生物、凋亡细胞、感染细胞、受损细胞或癌细胞。 几种类型的免疫细胞，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和B细胞都可以进行吞噬。 几个小组报告了基于微球的HTFC吞噬试验的发展。 这些HTFC吞噬试验已经在THP-1细胞、人和鼠中性粒细胞和人全血中建立起来，以确定临床抗体样本的吞噬活性，确定抗体介导的对一系列病毒(包括流感、HIV、埃博拉和登革热)的吞噬作用，以及确定研究结核感染期间的人体免疫反应。 所有这些已报道的吞噬试验都涉及到抗原包被荧光微球的使用，这种微球可以在与Fc受体结合时形成抗原特异性抗体/抗原免疫复合物，并被吞噬细胞摄取。 基于微球的流式细胞仪吞噬分析提供了节省样品、抗原性灵活、高通量的优势，优于其他吞噬分析方法，如使用荧光素或罗丹明标记颗粒的成像分析、溴化乙锭摄取分析和使用pH敏感荧光染料的分析。

中性粒细胞是一种招募到感染部位的白细胞，通过保护宿主免受入侵病原体的侵袭，在帮助解决感染方面发挥着重要作用。 中性粒细胞的功能包括吞噬、产生活性氧(ROS)、降解和形成中性粒细胞胞外陷阱(NETs)。 HTFC检测已经被开发和验证，可以直接定量纯化的中性粒细胞和混合细胞群体的血液样本中的NETs，而不需要分离中性粒细胞。 HTFC NET分析允许快速评估每个样本中的大量中性粒细胞以生成可重现的数据，并提供了一个筛选异常NETs形成抑制剂的良好工具，并显示出明显优于其他NET评估方法，因为其它方法需通过密度离心分离中性粒细胞，这可能会导致细胞耗竭和激活。

T细胞受体(TCR)抗原活化诱导的T细胞活化可影响细胞的存活、增殖、成熟和分化。 T细胞活化增强与许多自身免疫性疾病有关，T细胞活化功能障碍可导致免疫反应降低。 因此，以TCR信号通路为靶点的治疗方法在治疗多种免疫相关疾病方面具有巨大的潜力。 JAK/STAT信号通路在调节T细胞功能中起着重要作用。 一种通过测量CD3+CD8+T细胞群中STAT5磷酸化来研究JAK/STAT信号的HTFC法已经被用来在人全血中用384孔板筛选4000种化合物。

HTFC在传染病中的应用
由病原体(如病毒、细菌、真菌或寄生虫)引起的感染可能导致病原体在体内复制增加，以及可能导致传染病和组织损伤的不必要(过度、错位或异常)炎症反应。 大多数传染病并发症很少，但有些传染病可以危及生命，如分枝杆菌引起的结核病，病毒、细菌或真菌引起的肺部传染病肺炎，人类免疫缺陷病毒引起的艾滋病，埃博拉病毒引起的出血热，严重急性呼吸综合征和最近由冠状病毒引起的新冠肺炎，以及疟原虫引起的疟疾。 尽管抗病原体治疗取得了成功，但现有药物仍存在治疗局限性，感染性疾病仍对人类健康构成重大威胁。 因此，需要新的更有效的药物来治疗各种传染病。

感染性病毒定量是抗病毒药物开发中需要评估的关键参数。 传统的感染性病毒滴度分析方法，如空斑分析和细胞培养感染剂量分析，都是实验室劳动力密集型的，而且通量低。 流式细胞术利用工程荧光蛋白报告基因的表达、荧光探针结合的抗体标记病毒蛋白或细胞形态学改变来测定传染性病毒滴度。 最近，发展了一种96孔无标记的病毒定量分析方法，它是利用侧面散射光测量感染细胞的颗粒，而不需要任何荧光报告[ogan M, Manalil J, Notte C, et al. A flow cytometric granularity assay for the quantification of infectious virus. Vaccine. 2019;37 (47):7090–7099.]。 作者证明，高颗粒度细胞的百分比与通过传统的空斑试验获得的病毒滴度有关，细胞颗粒度的变化是由于病毒复制所致。 汉坦病毒是引起肾综合征出血热和心肺综合征的一组病原体，病死率很高。 Buranda等人提出了一种384孔HTFC检测方法，用紫外线灭活的荧光标记病毒检测病毒颗粒与Tanoue B细胞表面靶标衰变加速因子(DAF)的结合，以找出抑制汉坦病毒进入细胞和感染的化合物[Buranda T, Gineste C, Wu Y, et al. A high-throughput flow cyto- metry screen identifies molecules that inhibit hantavirus cell entry. SLAS Discov. 2018;23(7):634–645.]。 对含有1200个化合物的Prestwick化学文库进行筛选，经细胞活性和病毒感染试验证实有8个化合物与抗霉素有协同作用。

尽管抗菌药物的开发取得了成功，但耐药性的产生已成为一个重要的临床问题。 许多种类的抗菌药产生抗药性的一个主要因素是微生物有能力通过外排泵输出药物。 抑制外排泵已成为克服耐药的一种有吸引力的方法。 新墨西哥大学分子发现中心和国家卫生研究院分子图书馆探针生产中心网络进行了大量的酵母或哺乳动物HTFC筛选，以发现抑制多药外排泵的化合物，包括ABCB1、ABCG2、ABCB6、空泡ATPase、CDR1、CDR2和MDR，方法是在不同的项目中使用细胞条形码方法筛选200,000到350,000种化合物，在每个孔中多路复用最多5种细胞类型。 此外，Haynes等人最近描述了HTFC染料积累试验的发展，以在病原菌模型中筛选抗性结瘤细胞分裂(resistance nodulation cell division，RND)，这是一种内膜转运蛋白家族。 HTFC技术使各种外排泵抑制剂的高通量和多路筛选成为可能，外排泵不仅在抗病原性耐药中发挥作用，而且在肿瘤耐药中也发挥作用。 因此，HTFC为发现新的抗病原和抗癌药物提供了极大的潜力。

HTFC在肿瘤学中的应用
如前所述，流式细胞术在分析免疫细胞等悬浮细胞方面具有独特的地位，这也使其成为免疫肿瘤学(IO)药物发现的一个有价值的工具。 在细胞治疗发现中，HTFC能够同时进行细胞毒性评估、免疫表型和嵌合抗原受体(CAR)转导效率的测量。 HTFC的一个经常被忽视的优点是在测试优化过程中能够快速测试许多不同的测试参数，例如如肿瘤和免疫细胞类型的密度(即效靶比)之类的生物变量、Accutase处理的持续时间等变量可以使用析因试验设计技术在一块平板上容易地优化。 这种有效的优化导致了对治疗的健壮和可重复性至关重要。 HTFC能够更经济地使用有限的初代细胞，特别是在384孔板时。 例如，HTFC已用于通过监测多个参数，包括T细胞标记物、成熟DC标记物、细胞增殖和细胞存活率的CellTrace染料水平，来评估共培养的树突状细胞(DC)和T细胞的激活状态，它使每孔使用的人类原代细胞比传统的流式细胞术分析通常所需的细胞少10倍。 该方法可用于检测其他免疫细胞的活性，如B、T细胞亚群，或免疫细胞与肿瘤细胞共培养。 使用核标记染料，Rabinovich等人在CAR T细胞与靶细胞和自体肿瘤浸润淋巴细胞、黑色素瘤细胞共培养中区分出活的或死的效应细胞和靶细胞。 对C8161人黑色素瘤细胞PD-L1和HLA1表达的HTFC分析表明，这些化合物分别导致PD-L1和HLA-1表达降低和升高，而对T细胞活化无负面影响，提示这些化合物可能增强肿瘤细胞的免疫原性。

传统的流式细胞仪，如BD LSRII，可以与自动平板取样器相连，并已用于计数，如胸腺细胞的激活和存活率，可用于分析细胞表面标志物图谱以识别肝细胞癌中的肿瘤起始细胞，还可用于检测96孔板中抗体阵列中细胞表面蛋白的表达。 对于悬浮细胞，如T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，HTFC已经被用来描述对酪氨酸激酶抑制剂的反应，用PI读出细胞死亡比例。 有趣的是，这项研究调查了低氧条件下化合物的孵育，确定了TKI依赖于氧浓度的不同作用，这可能是针对低氧骨骨髓微环境的关键因素。 HTFC还被用来通过筛选与HEK293细胞过度表达的ILDR2结合的Fab，并显示Fab竞争结合ILDR2来识别Fab片段。

除了免疫肿瘤学的应用，HTFC还被用于筛选超过8万种化合物，以寻找非同源末端连接(NHEJ)介导的DNA修复的抑制剂。 该筛选使用定制的群集细胞测量平台，可以同时从4x384孔板上取样。 为了进一步简化方案，前向散射和侧向散射光分别用于识别增殖和细胞活性，GFP信号直接用于测量NHEJ，而不需要额外的染料或抗体标记步骤[Bredemeyer AL, Edwards BS, Haynes MK, et al. High-throughput screening approach for identifying compounds that inhibit nonho- mologous end joining. SLAS Discov. 2018;23(7):624–633.]。 进一步的研究可以用γH2AX作为双链断裂的标记物，使用mre11作为双链断裂修复的标记物，并且已经被用来表明与有反应者相比，对PARP抑制剂无反应者的γH2AX/mre11的比率要高得多[Lee JM, Gordon N, Trepel JB, et al. Development of a multiparameter flow cytometric assay as a potential biomarker for homologous recombination deficiency in women with high-grade serous ovarian cancer. J Transl Med. 2015;13(1):239.]。 最近另一篇文献介绍了一种用谷胱甘肽包被的微球捕获GST-RBPJ融合蛋白的HTFC分析方法，并以含有RBPJ结合基序的荧光DNA为示踪剂筛选RBPJ-DNA相互作用的抑制剂。 这项筛选和后续的细胞分析一起确定了Auranofin可以破坏RBPJ-DNA相互作用，并下调参与癌细胞启动和增殖的Notch依赖的转录激活[Lake RJ, Haynes MK, Dreval K, et al. A novel flow cytometric assay to identify inhibitors of RBPJ-DNA interactions. SLAS Discov. 2020;25(8):895–905.]。

流式细胞仪在分析外泌体方面也是独一无二的，MACSQuant等HTFCs已被用于量化复合治疗后前列腺癌细胞模型中的外泌体释放。

细胞表面蛋白具有重要的生物学功能，如信号转导、离子转运和细胞粘附等。 许多细胞表面蛋白被广泛用作细胞特异性标记物，流式细胞术已广泛用于评价单个悬浮细胞表面蛋白的表达。 Gedye等人报道了一项利用HTFC平台对癌细胞系、急性髓系白血病细胞、人PBMC和正常皮肤成纤维细胞等14种细胞100多个样本的363个细胞表面蛋白进行快速分析以寻找生物标志物的研究。 细胞表面标志物筛选提供了足够的分子信息来将筛选的样本分成生物学上相关的不同群体，并已将CD90确定为浆液性卵巢癌中癌症相关成纤维细胞的候选表面标志物。

HTFC在炎症性疾病中的应用
慢性炎症涉及多种免疫细胞，是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、慢性肾病、糖尿病、类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)等多种慢性疾病的诱因和相关因素。 这些细胞产生并释放各种细胞因子到细胞外空间，以调节相邻细胞的功能。 基于微球的流式细胞术分析已经成为细胞因子和分泌蛋白多重定量的强大利器。 一项头对头的研究比较了HTFC384孔Qbeads分析、96孔MSD、Luminex分析、96孔ELISA、384孔HTRF、AlphaLisa分析，定量检测小鼠支气管肺泡灌洗液样本、THP-1细胞分析上清、人单核细胞来源树突状细胞分析上清以及人类CD4+细胞分析上清中的多种细胞因子，结果表明，HTFC Qbeds检测与相应的MSD、ELISA、HTRF和AlphaLisa检测具有良好的相关性。 此外，Qbead试剂盒允许在单个样本中多路复用30种独特的分析物，并提供更宽的检测范围、更低的成本和时间效率，这使得基于微球的流式细胞术成为药物发现和生物标记物研究中从大样本集中筛选多种细胞因子的有力选择。

抑制SIK（Salt-Inducible Kinase）可重新编程巨噬细胞，导致抗炎细胞因子的产生增加，促炎症细胞因子的产生减少。 SIK被认为对慢性阻塞性肺病(COPD)的一种类型--慢性支气管炎的解决非常重要。 Ding等人报道了一种基于微球的HTFC分析方法，利用从病人肺切除中分离的人肺泡巨噬细胞同时定量IL10(抗炎细胞因子)和TNFα(促炎细胞因子)，以驱动结构-活性-关系筛选，以发现用于治疗慢性支气管炎的SIK抑制剂，作者通过使用2μL/孔的细胞上清液、2μL/孔的混合捕获微球和2μL/孔的检测试剂，以384孔法进行小型化，以克服从每个患者获得的人肺泡巨噬细胞数量有限的挑战，并降低试剂成本。 在发现治疗慢性支气管炎的SIK抑制剂的过程中，这项检测为先导优化提供了结构-活性-关系筛选。

哮喘是一种复杂的慢性炎症性疾病，与气道炎症、气道高反应性(AHR)和气道结构重塑相关。 Rac1是Rho家族GTPases的成员之一，已被证明是一个有意义的靶点，参与气道平滑肌细胞过度收缩引起的AHR。 据报道，Bardelle C等人用HTFC筛选了500,000种化合物，用于鉴定rac1 GTPase抑制剂，使用谷胱甘肽包裹的微球捕获GST标记的GTPase，并使用荧光GTP作为示踪剂来鉴定与GTP与GTPase结合的化合物竞争的化合物，该方法采用1536孔法，测定体积为6μL/孔，取样体积为1μL/孔，通过对先前建立的384孔Rho GTPase分析方法进行优化而建立的[Bardelle C, Sauzeau V, Carter MB, et al. High throughput screen for inhibitors of Rac1 GTPase by flow cytometry. In: Gemei M editor. Multidimensional flow cytometry techniques for novel highly infor- mative assays. London: IntechOpen Limited; 2018:43–61.]。

GTP酶在细胞的生长、存活、运动、形态发生和分化过程中也起着重要作用。 突变或高激活的GTP酶参与肿瘤的发生和感染性疾病。 已经报道了一个20万个复合物的多路HTFC筛选，用于6个GTP酶(Cdc42、Rab2、Rab7、激活的rac1Q61L、rac1和H-RAS)的激活子筛选。 该筛选使用荧光GTP和谷胱甘肽包被的微球组，用不同数量的红色荧光染料标记，通过测量荧光GTP与单个GST-GTP酶的结合来筛选GTP酶激活剂。 在Hela、Swiss 3T3或RBL-2H3细胞中的跟踪研究表明，先导化合物能够稳定GTP结合的活性形式，并诱导细胞表面拓扑和外形的改变。

中性粒细胞是第一种被招募到炎症部位的细胞类型。 HTFC技术已经能够分析从健康人和慢性牙周炎患者的血液和口腔漱口液中分离出的中性粒细胞群体中374种表面蛋白的表达[Lakschevitz FS, Hassanpour S, Rubin A, et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 2016;342(2):200–209.]，该研究提出了用一组表面蛋白作为成熟中性粒细胞的标志物，并将CD11b、CD16和CD66b确定为与细胞位置、活化程度和疾病状态无关的中性粒细胞标志物。 它还表明，与来自健康、非炎症组织的中性粒细胞相比，炎症组织中性粒细胞表达了一套独特的表面标记。

HTFC在其他疾病中的应用
与HTFC在免疫、感染、免疫肿瘤学和炎症性疾病的药物发现中的广泛应用相比，最近只有少量的HTFC应用于筛选和研究涉及神经退行性疾病、心血管疾病和代谢性疾病的靶点。 这可能部分是因为这些疾病涉及的许多关键细胞类型本质上是贴壁细胞，这使得HTFC的应用更具挑战性，因为在采集样本之前需要将细胞解离为单细胞悬液。 这通常涉及额外的胰蛋白酶步骤和可能的过滤步骤，以去除成团的细胞。

酵母菌与人类细胞具有共同的保守分子和细胞机制，是研究神经退行性疾病和衰老相关疾病等人类疾病的有价值的快速生长系统。最近，伊达尔戈等人提出了一种基于酵母的HTFC方法，该方法使用GFP标记的酵母朊蛋白淀粉样蛋白来研究蛋白质的错误折叠和聚集，通过GFP信号脉冲的高度、面积和宽度参数来评估朊病毒淀粉样蛋白的聚集，并筛选酵母缺失文库。 这项检测可以应用于研究其他聚集性蛋白底物，如亨廷顿蛋白（这些突变会导致亨廷顿氏病）。 基于酵母的抗衰老药物发现在确定潜在靶点方面也被证明是非常成功的，一种基于酵母的HTFC筛查出延长寿命的化合物为terric acid和霉酚酸。

总结
由于HTFC能够以微型化的形式工作，因此可以在药物发现的早期阶段对样本进行高效和快速分析。 此外，使用多孔板可以研究许多不同的因素，以检验细胞模型中的组合效应。 总而言之，这将导致快速识别和失败有效和无效治疗的成功率提高，这是导致药物发现项目更成功的原因。

虽然目前的HTFC平台已经使流式细胞术作为药物发现筛选工具可行，但仍然存在一些明显的挑战。 从实用的角度来看，在筛查过程中可能会发生流体和检测系统的意外堵塞，导致样品的潜在损失。 这使得HTFC筛选很难完全自动和无人值守地运行。 因此，发展HTFC系统，减少对药物发现易受堵塞问题的影响，将有利于HTFC在药物发现中更广泛的应用。 在流式细胞仪样本采集之前，通常需要对细胞表面或细胞内的蛋白质进行染色，或者对用于分析溶液中蛋白质的颗粒进行染色。 细胞或颗粒染色常需要多个洗涤和培养基去除步骤，这是流式细胞术另一个变异性来源。

节选自PDF原文： 10.1080@17460441.2021.1826433.pdf (761.77 KB, 下载次数: 11)

2020-10-27 15:19 上传

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