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2021诺奖发现的TRPV1,流式能够快速检测,赶紧开始研究起来

发布者: niwanmao | 发布时间: 2021-10-5 14:05| 查看数: 298| 评论数: 9|帖子模式

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瞄了一些今天的动态,发现都说解释了为什么吃辣椒会头痛、肚子痛之类的,实际上这只是直接层面的意义,这项成果不仅解释了感受温度的机制,更深层次的是对治疗上面的启发,例如疼痛、癌症治疗等。

Transient Receptor Potential Vanilloid-1 (TRPV1)蛋白是一种跨膜、非选择性阳离子通道,可被各种刺激活化,包括热、酸性 pH、辣椒素和其他植物来源的香草素,该受体是Julius等人在2001年发现的,就在昨天,Julius等人由此得了诺贝尔医学及生理学奖。

该受体尽管以感染热、辣椒素等伤害性因素而广为人所知,但实际上已在许多癌症中检测到 TRPV1 表达,包括胶质瘤(Contassot, et al.2004a)、乳腺癌(Weber, et al.2016)、前列腺癌(Sánchez, et al.2005)、结肠癌腺癌(Domotor, et al.2005)和胰腺癌(Mergler, et al.2012)。值得注意的是,辣椒素是一种香草素和 TRPV1 激动剂,被发现通过 TRPV1 依赖性和非依赖性机制对许多癌细胞系具有细胞毒性,这提高了可以在治疗上利用 TRPV1 表达的前景。迄今为止,对正常血细胞或血液系统恶性肿瘤中 TRPV1 表达的评估有限(Omari, et al.2017)。已在大鼠血液中性粒细胞(Wang, et al.2005)、小胶质细胞、脑内巨噬细胞(Kim, et al.2006)和人类血液白细胞(Spinsanti, et al.2008;Saunders, et al.2007)中也能检测到 TRPV1。在人类树突细胞 (DC) 中也检测到 TRPV1 蛋白,因为它在 DC 成熟中起作用(Toth, et al.2009),而关于小鼠 DC 中的 TRPV1 蛋白和 mRNA 表达仍存在争议(Connell, et al.2005)。TRPV1 的激活及其在 THP-1 单核细胞迁移和粘附以及 U937 细胞凋亡中的作用(Maccarrone, et al.2000;Himi, et al.2012;Schilling 和 Eder 2009)。在体外用辣椒素处理血液细胞系 THP-1、U266B1 和 U937 会导致细胞凋亡(Omari, et al.2016)。

由于TRPV1 是一种跨膜蛋白,并且现在有商品化抗TRPV1抗体,所以流式细胞术是非常理想的检测方法。然而,之前使用流式细胞术分析 TRPV1 表达的研究阴性或同型对照关注不够,或者在使用靶向细胞内抗原的抗体时有些文献忽略破膜步骤(Caprodossi, et al.2011a;Huang, et al.2010;Amantini, et al.2004 ;Amantini, et al.2007;Amantini, et al.2009)。故需要有一个优化的方案。

步骤
1. 取100ul样本,加入能够区分细胞群体的表面标记,避光、室温孵育10分钟。
2. 加入红细胞裂解液,避光裂解10分钟。
3. 350g离心5分钟,然后用PBSA(PBS+10%FBS+0.1叠氮钠)洗涤两次。
4. 用商品化固定/破膜剂,进行固定和破膜,接着进行阻断15分钟(破膜缓冲液中加入10%AB型血清、1%BSA、0.05%叠氮钠)。
5. 与0.5ug rabbit polyclonal anti-TRPV1 (Lifespan Biosciences),4度避光孵育45分钟。另一管同型对照,其它几步完全相同,就这一步用0.5ug同型对照孵育。
6. PBSA洗涤后,加入二抗(1:25),4度避光孵育20分钟。
7. PBSA洗涤两次,PBS重悬,上机检测。

结果展示
目前市场上有三家商品化的TRPV1抗体,但从实验效果来看,只有Lifespan Biosciences的LS-C150735货号,可以在几种恶性血液肿瘤细胞株中检测到明显的分群。下图就是用LSC150735 在 THP-1、U266B1、U937 细胞和健康人淋巴细胞中的检测结果,可见TRPV1信号能与同型对照明显分群:
20211005_135851.jpg

以血液系统恶性肿瘤患者为例,其TRPV1表达水平较健康对照 (n=20) 有上调(P=0.0351,非配对 t 检验)。 细分的话,B-NHL 患者的 TRPV1 显著高于对照(P=0.0294,Dunnet 检验),不过初发和化疗后的患者,其TRPV1表达水平与对照无统计学差异:
20211005_140213.jpg


信源:Sofia A Omari, et al.Optimized Flow Cytometric Detection of Transient Receptor Potential Vanilloid-1 (TRPV1) in Human Hematological Malignancies. medRxiv 2021.08.04.21261521; doi: https://doi.org/10.1101/2021.08.04.21261521

最新评论

小能手 发表于 2021-10-8 09:16:27
请问实验流程中PBSA的作用是什么?
niwanmao 发表于 2021-10-8 14:05:08
小能手 发表于 2021-10-8 09:16
请问实验流程中PBSA的作用是什么?

常规实验流程中,都可以用,一方面对细胞活力有好处,其次,能够一定程度上减少非特异性背景。
小能手 发表于 2021-10-9 09:10:58
niwanmao 发表于 2021-10-8 14:05
常规实验流程中,都可以用,一方面对细胞活力有好处,其次,能够一定程度上减少非特异性背景。 ...

这么说,PBSA可以在除细胞凋亡检测外的常规流式检测中替代PBS,尤其是TIL的检测
niwanmao 发表于 2021-10-9 13:53:37
小能手 发表于 2021-10-9 09:10
这么说,PBSA可以在除细胞凋亡检测外的常规流式检测中替代PBS,尤其是TIL的检测 ...

对于细胞容易死亡的标本,用PBSA或许可以改善,但最重要的还是标本处理手法上。
小能手 发表于 2021-10-11 12:34:41
niwanmao 发表于 2021-10-9 13:53
对于细胞容易死亡的标本,用PBSA或许可以改善,但最重要的还是标本处理手法上。 ...

谢谢倪老师的解答,我还想一下,和FACS液相比,PBSC在降低非特性染色有更好的效果,但在降低细胞死亡率上效果差不多,对吗?
niwanmao 发表于 2021-10-11 12:50:42
小能手 发表于 2021-10-11 12:34
谢谢倪老师的解答,我还想一下,和FACS液相比,PBSC在降低非特性染色有更好的效果,但在降低细胞死亡率上 ...

我不知道你指的FACS液是哪个?是什么成份? 重要的是成份里面有没有相关保护的东西在里面。
小能手 发表于 2021-10-11 13:58:01
niwanmao 发表于 2021-10-11 12:50
我不知道你指的FACS液是哪个?是什么成份? 重要的是成份里面有没有相关保护的东西在里面。 ...

是PBS加FBS
niwanmao 发表于 2021-10-11 16:31:32

那是一样的呀,就是少了防腐剂,容易长菌。
小能手 发表于 2021-10-12 16:20:28
niwanmao 发表于 2021-10-11 16:31
那是一样的呀,就是少了防腐剂,容易长菌。

哦,我明白了,谢谢倪老师
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