艾森ACEA NovoCyteTM流式细胞仪检测调节性T细胞 (Treg)

调节性T细胞 (Treg) 是近年来免疫学领域研究的热点，它们不仅参与维持机体免疫平衡，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要作用^1,2。一些自身免疫性疾病如多发性硬化症、活动性类风湿性关节炎、I型糖尿病等Treg细胞的数量和功能均会发生变化³。在许多恶性疾病如肺、胰腺和乳腺癌等已经发现Treg细胞明显增高。因此，对Treg细胞进行深入研究将有助于了解自身免疫性疾病的发病机制，对疾病预后判断、进一步的治疗有着深远的意义。

根据来源及作用机制，Treg主要可分为天然Treg和诱导性Treg。天然T细胞（nTreg）约占外周血及脾脏CD4＋ T细胞的5%～10%。nTreg除表达CD4和CD25外，还特异性高表达转录因子Foxp3⁴。

流式细胞仪的高速、定量及多参数检测为分离及研究Treg细胞带来了便利。ACEA NovoCyte^TM流式细胞仪（图1）支持自动化智能化的流式检测。

ACEA NovoCyte流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞Treg细胞首先通过以下流程设置参照并进行样本处理：设立阳性管和同型对照管，每管取5x10⁵小鼠脾细胞，分别加入CD4-FITC和CD25-PE单克隆抗体各10µl，4°C避光孵育30min，PBS洗涤重悬后继续进行FOXP3染色。细胞表面CD4-FITC和CD25-PE染色后，固定剂室温避光15min；破膜剂洗涤后，加鼠血清封闭，4°C避光15min。再加入FOXP3-APC或同型对照IgG2a-APC各10µl，4°C避光孵育40min，破膜剂洗涤后重悬，上ACEA NovoCyte流式细胞仪检测。

使用ACEA NovoCyte流式细胞仪进行小鼠脾脏细胞Treg细胞检测，只需要进行简单的检测条件设置，而无需调节PMT增益电压即可开始数据采集。仪器自动收集并通过软件展示所获得的细胞信号，对于目的检测细胞可以通过拖曳放大功能确定并进行分析（图2）。ACEA NovoCyte提供用户友好的可视化快速补偿功能，直接调节补偿滚动条即可直观方便地进行荧光补偿，并可通过通道的荧光均值（或中位数）检测补偿效果。除了手动补偿功能外，NovoCyte还提供自动荧光补偿方法。此外，对于复杂的多色荧光参数分析时，ACEA NovoCyte流式细胞仪支持实验结束后的脱机离线补偿方式，以节约数据采集和检测的时间。实验结束后，系统可自动打印和生成PDF格式的检测报告。

图3为ACEA NovoCyteTM流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞中的Treg细胞的结果，根据前向角和侧向角（FSC/SSC）圈定淋巴细胞设门E16，测定CD4+CD25+T细胞表达，从中测定胞内FOXP3表达，图中CD4＋CD25＋FoxP3+群体为Treg细胞。

ACEA NovoCyte^TM流式细胞仪在检测Treg细胞中充分展示了自动简便的检测优势。高达10⁷的动态检测范围方便实验者无需进行PMT增益电压调节即可进行检测的便利实验操作；创新的数字信号处理技术及高达>15,000颗粒/秒的采样速率，配合智能化NovoExpress分析软件，更高效、精确地完成复杂的流式检测与分析，这是经典流式细胞仪难以比拟的。ACEA NovoCyteTM流式细胞仪的超高检测灵敏度（FSC：0.5μm，SSC：0.2μm，FITC<75MESF，PE<50MESF），对弱阳性样本同样具有精确的分辨能力，使稀有样品的分析以及功能研究中检测弱信号等成为可能。

Treg细胞的研究虽然取得了众多进展，但尚有许多问题亟待解决，例如各种Treg细胞间的相互关系如何？不同Treg细胞的膜表面分子标志是什么？Treg细胞是如何产生分化的？Treg细胞如何与靶细胞相互作用的？对Treg细胞的作用机制和免疫生物学特性研究的进展必将有助于了解自身免疫性疾病及肿瘤的发病机制并为疾病的治疗探索带来新的思路。

参考文献：

[1] Sakaguchi S., Nautally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol, 2004,22:531-562.

[2] Aswad, F., Kawamura, H., and G. Dennert. 2005. High Sensitivity of CD4+CD25+ Regulatory T Cells to Extracellular Metabolites Nicotinamide Adenine Dinucleotide and ATP: A Role for P2X7 Receptors. J Immunol. 175:3075-3083.

[3] Palomares O, Yaman G, Azkur AK, Akkoc T, Akdis M, Akdis CA. Role of Treg in immune regulation of allergic diseases.  Annu Rev Eur J Immunol. 40:1232-40

[4] Fererer M, Hill JA, Mathis D, Benoist C., Foxp3+ regulatory T cells: Differentiation, specification, subphenotypes. Nat Immunol 2009; 10:689-695.