利用磷酸化流式细胞术检测PBMC信号转导（资源）

2017-1-3 22:46| 发布者: wendy1975| 查看: 932| 评论: 12|原作者: niwanmao

摘要: PBMC中存在的各类免疫细胞是异质性的，单单CD4＋T细胞就存在数十种功能亚群。各类信号（如细胞因子、趋化因子、各种受体配体结合、T或B细胞受体连接）介导的信号转导代表着免疫细胞之间存在一些重要的关联，而PBMC中 ...

PBMC中存在的各类免疫细胞是异质性的，单单CD4＋T细胞就存在数十种功能亚群。各类信号（如细胞因子、趋化因子、各种受体配体结合、T或B细胞受体连接）介导的信号转导代表着免疫细胞之间存在一些重要的关联，而PBMC中的各类免疫细胞，其信号转导的方式各式各样。如果不分细胞亚群，直接用PBMC整体作为研究对象，会模糊各类细胞之间信号转导的差异性，因此，在单个细胞水平进行不同种类免疫细胞信号转导研究是十分必要的。

Gary Nolan博士及其团队是将流式细胞术结合磷酸化蛋白抗体应用于单细胞水平信号转导研究的先驱，他们将此技术命名为磷酸化流式细胞术，即phosflow。在phosflow中，用信号受体配体和/或其它拮抗剂刺激PBMC或其它细胞一段时间，然后用多聚甲醛固定细胞，使其稳定在磷酸化的状态，然后破膜，以荧光标记的针对磷酸化蛋白的抗体染色，并辅以其它标记区分不同细胞群体，最后上机分析。

利用phosflow，我们可以通过STAT家族的磷酸化水平分析各种细胞因子的作用，以及分析T细胞受体和B细胞受体活化后、Toll样受体联结后下游分子（如NF-κB p65、ERK、p38、ZAP70等）磷酸化改变。下图就是一个p38蛋白在不同刺激条件下的磷酸化表达改变情况。
p38的磷酸化水平检测

在优化磷酸化检测方法时有以下几点需要考虑：
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1、选择合适的破膜方法。Nolan及其团队发布的方法是固定细胞后采用100％甲醇破膜，这是最常用的方法，用该方法的优点是甲醇固定后，细胞可保存在-20℃或-80℃很长时间，这样你就可以在不同时间进行标本刺激、收集，最后一起标记和检测磷酸化蛋白，可以减少不同次实验之间的差异。此外，还有不少相关的适合磷酸化蛋白检测或其它抗原的商业化缓冲液，也是可以考虑的。
2、选择合适的目标抗原，以区分出目的细胞群。某些抗原可能在破膜过程中，受到破膜剂甲醇或其它试剂影响而被破坏，例如在用CD19区分B细胞或CD14区分单核细胞时，就受甲醇影响很明显，此时可分别改用CD20和CD33，就能取得很好的效果。

Cytobank是Gary Nolan实验室为了磷酸化检测而设计的网站（当然，现在还增加了在线数据存储和分析功能），有助于我们选择磷酸化检测的合适的抗原和克隆号。上面会列出一些用BD破膜剂测试成功或不成功的例子。
总之，phosflow是分析信号转导事件的非常好的方法，对单细胞磷酸化水平及信号转导检测的深入，可提高我们对免疫系统复杂性的认识。

Nolan实验室的Phosflow protocol:
Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Schulz KR, Danna EA, Krutzik PO, Nolan GP.Curr Protoc Immunol. 2012 Feb;Chapter 8:Unit 8.17.1-20.
BD Biosciences Phosflow主页:
http://www.bdbiosciences.com/res ... p?WT.ac=FP_Phosflow
Cytobank用各类破膜缓冲液测试的抗体列表：
http://www.cytobank.org/facselect/

深入阅读：
Flow cytometric analysis of cell signaling proteins. Suni MA, Maino VC. Methods Mol Biol. 2011;717:155-69.
Single-cell, phosphoepitope-specific analysis demonstrates cell type- and pathway-specific dysregulation of Jak/STAT and MAPK signaling associated with in vivo human immunodeficiency virus type 1 infection. Lee AW, Sharp ER, O'Mahony A, Rosenberg MG, Israelski DM, Nolan GP, Nixon DF. J Virol. 2008 Apr;82(7):3702-12.