想问一下CD25、TH1、TH17单染管没有染上的原因

lm951219

大家好，我是做流式小白，最近在做小鼠脾脏的TH细胞的分析定量
1.做的单阳管找不到CD25, TH1、TH17的峰图，不知道是软件不会用，还是就是没有染上色，抗体和破膜剂都是用的BD的，下面的是我的图片
2.CD25用的是BB515通道，CD4是BB700,IFN-γ是PE-CY7,IL-17A是PE通道

lm951219

顶一下，希望各路大神给点意见，哈哈

ccx793244586

有上机检测的原始文件吗，我的IFNγ也是染色不好，不过CD25 跟 IL-17都还可以

lm951219

ccx793244586 发表于 2022-8-5 11:36
有上机检测的原始文件吗，我的IFNγ也是染色不好，不过CD25 跟 IL-17都还可以

有，你的单阳管峰图明显吗，所以感觉是没染山

niwanmao

三根单阳管，你分别是用什么样本染的？

lm951219

niwanmao 发表于 2022-8-5 13:16
三根单阳管，你分别是用什么样本染的？

倪老师，都是来自脾脏研磨分离出来的单细胞悬液

niwanmao

lm951219 发表于 2022-8-5 14:35
倪老师，都是来自脾脏研磨分离出来的单细胞悬液

1、确实圈的是T细胞。
2、确认补偿是否正确。

ccx793244586

lm951219 发表于 2022-8-5 11:52
有，你的单阳管峰图明显吗，所以感觉是没染山

明显，最近IFNγ的也好一点了，因为我的IFNγ是用BV-450标记的，荧光没那么强。
我之前IFNγ没染色上一开始怀疑是抗体的问题，但是跟厂家的技术反复确认实验重复后发现是商品化的白细胞刺激剂对细胞密度的要求，脾脏细胞的密度不要大于2*10^6，我之前刺激过程中细胞的密度偏大，在4*10^6，导致刺激还有阻断这一过程效果不理想。
最好是把每步的实验操作具体写出来发给代理商还有厂家，让他们找问题，可以选择申诉抗体问题让厂家技术过来现场看着做实验，厂家的技术还是比代理商的技术专业很多的。
如果排除除了抗体以外的试剂还有操作本身的问题就大胆地质疑抗体出问题。

ccx793244586

ccx793244586 发表于 2022-8-8 10:25
明显，最近IFNγ的也好一点了，因为我的IFNγ是用BV-450标记的，荧光没那么强。
我之前IFNγ没染色上一开 ...

不好意思刚刚说错了，CD25明显，但是IFNγ跟IL-17不明显，除非感染或者疾病程度非常严重，一般脾脏T细胞的Th1，Th17不会高的，只是能在散点图上明显地看出有成群的趋势