全血免疫细胞检测标准化，可参考这篇

niwanmao

了解移植受者在标准免疫抑制、免疫细胞疗法和新药物治疗方面的免疫细胞组成对于改善移植结果至关重要。 通过多色流式细胞术进行的免疫监测是评估移植免疫反应的非常有用的工具，并且有可能深入了解治疗成功的机制。
此外，通过流式细胞术对全外周血 (WPB) 进行免疫细胞检测是一种可靠、快速且简便的方法，可获取大量关于健康个体的信息，以及不同治疗方法在移植中的效果和结果，且对患者的影响很小。
虽然移植后的短期结果非常好，但长期结果仍不理想。移植排斥仍然是移植物功能丧失的主要原因。急性排斥反应是一个由适应性免疫反应激活引起的复杂过程，由涉及 NK 细胞、单核细胞-巨噬细胞和中性粒细胞 固有免疫系统的激活启动，参与同种异体识别的初始步骤。固有免疫的活化导致T细胞活化，在排斥过程中起核心作用。此外，FOXP3+ 调节性 T 细胞 (Tregs) 是几种类型的调节性细胞之一，已被证明在动物模型和临床环境中可防止排斥并促进移植耐受。在肾移植免疫细胞疗法的多中心 I/II 期研究“ONE 研究”中，研究了FOXP3+Treg 细胞的安全性和预防肾移植后急性排斥反应的能力（www.onestudy.org )。除了T 细胞亚群的作用外，B 细胞，特别是调节性 B 细胞 (Bregs)以及能够促进移植排斥或耐受的树突状细胞 (DC) 的作用也已被广泛关注。
因此，对患者进行免疫细胞检测可能有助于确定急性排斥和/或移植物功能丧失的风险概况。
流式细胞仪检测的复杂性包括多步骤、多试剂检测，然后在多色流式细胞仪上采集样本。跨仪器染色方案的兼容性、适用性和标准化对于结果的可比性至关重要。Jimenez Vera E等人在“One Study”标准化工作的基础上，针对胰岛移植受者开发了一套标准化方法，包括样品处理、试剂、抗体混合物、染色方案、仪器设置和数据分析的标准化，建立了7 个白细胞分析方案，可检测 B、NK、单核细胞、DC 和粒细胞的亚群和/或状态，同时专注包括 NKT 和 FOXP3+Tregs 在内的特殊T细胞。

抗体组成和用量



方案



分析设门

第1管因为是用于绝对计数，设门很简单，就是把T、B、NK、单核等做一个绝对计数，后面的7管，就可基于此分母，通过相对比例计算绝对数。

第2管分析常见的主要免疫细胞：总B、总T、CD4+、CD8+、CD4-CD8- 和 CD4+CD8+ 亚群、CD3+CD56+ NKT 细胞、CD16+CD56+bright NK 亚群、CD16-CD56+bright NK 亚群、CD16-CD56+ NK 亚群、经典 (CD14+brightCD16-)、中间 (CD14+brightCD16+)、非经典 (CD14+dimCD16+bright)。

第3管主要是分析DC。通过HLA-DR+LIN-（CD3CD14CD19CD20CD56）排除 CD14+ 单核细胞、CD3+ T、CD19+ 和 CD20+ B、CD56+ NK 细胞，然后排除粘连体，在CD11c+HLA-DR+ 中分析 CD141+mid/bright mDC2、CD141-mDC1 和 CD16+ DC，在CD11c-HLA-DR+ 中分析pDCs CD303+CD123+ (pDCs) 和 CD303-CD123-/dim HLA-DR+ 未成熟pDC。



第4管主要分析B细胞亚群组成，对CD19+ B 细胞 (G5) 设门后，使用 CD27 和 IgD 表达分出 IgD+CD27- naïve 和 CD27+IgD- 记忆 B 细胞；在 IgM+IgD+ (G6) 上设门后，使用 CD38 和 CD27 表达分出CD27+CD38+ 和 CD27+CD38- 非转换记忆 B 细胞；在对 IgM-IgD- (G7) 进行设门后，使用 CD38 和 CD27 表达鉴定了 CD27+CD38强表达的浆母细胞 (Plas) 和 CD27+CD38+dim 类型转换记忆 (CSM) B 细胞；在对 IgM+CD27-B 细胞进行设门后，通过CD38 与 CD24 分出 CD24+brightCD38+bright 过渡 B 细胞；在 IgM+brightCD24+bright 上设门后，通过CD21 和 CD27 表达分出可能是调节性 B 细胞的 CD21+CD27- B 细胞；对 CD38-CD21- (G10) 和 CD38-CD21low (G11) 进行设门分出先天样或记忆 B 细胞 (CD38 vs CD21) 、CD27+brightCD24+bright 和 CD27+brightCD24low/- B 细胞。
第5管是分出T细胞各常规亚群，并通过CD57、CD45RA 与 HLA-DR 以及 CD28 与 CD27评估 T 细胞活化。


第6管是确定T细胞功能效应状态。分出CD8+ T 细胞 (G6) 或 CD4+ T 细胞 (G7) 后，通过CD45RA/CCR7、CD45RA/CD62L分出初始T (CD45RA+CCR7+/CD62L+)、中央记忆T (CD45RA -CCR7+/CD62L+)、效应记忆T (CD45RA-CCR7-/CD62L-) 和终末分化效应记忆T (TEMRA) (CD45RA+CC7-/CD62L-) 。 CD8 vs CD25 和 CD4 vs CD25 可分别用于估计 CD8+CD25+、CD8+CD25+bright、CD4+CD25+ 和 CD4+CD25+bright T 细胞的比例。Treg通过CD4+CD25+CD127-/dim 圈出，并通过CCD45RA/CCR7、CD45RA/CD62L分出 CD45RA+CCR7+/CD62L+ 初始 Tregs 与 CD45RA-CCR7+/CD62L+ 和 CD45RA-CCR7-/CD62L- 激活的 Tregs。
第7管分出γδT细胞和中性粒。CD3+CD45+ T 细胞 (G5a)设门后，通过TCRαβ 与 TCRγδ分析CD3+ T 细胞中 TCRαβ 和 TCRγδ 的比例。对 TCRγδ (G6a) 和 TCRαβ (G7a) 设门后，通过CD4 与 CD8 分别分析这两个细胞群中 CD4+、CD8+、CD4-CD8-和/或 CD4+CD8+ T 细胞的比例并分析CD45RO+ 和 CD45RO- 细胞群上 CXCR3 和CD88 (C5aR)的表达。中性粒细胞 (G2b) (CD45+dimSSC-Ahigh) 分别分析CD16和CD88 (C5aR) 的MFI。



第8管和第6管有部分重叠，主要是通过foxP3和127不同策略分析Treg的功能群体。

上面这些方案、抗体克隆号、用量、分析逻辑，都值得大家在实践中借鉴，尤其是需要多中心协作时，这些细化的规定，可以给结果稳定带来很大的保障。

信源：Jimenez Vera E, Chew YV, Nicholson L, et al. Standardisation of flow cytometry for whole blood immunophenotyping of islet transplant and transplant clinical trial recipients. PLoS One. 2019;14(5):e0217163. Published 2019 May 22. doi:10.1371/journal.pone.0217163

ccx793244586

倪老师您好，我麻醉后摘小鼠眼球取血，30倍体积1X 裂红液裂红5min，然后进行流式染色，染色了表面markerCD4CD8CD45CD11b，但是FCS-A SSC-A没有典型的三群，请问可能是血液样品染色前处理的哪个问题呢 感谢！

niwanmao

ccx793244586 发表于 2023-3-25 22:16
倪老师您好，我麻醉后摘小鼠眼球取血，30倍体积1X 裂红液裂红5min，然后进行流式染色，染色了表面markerCD4 ...

有些仪器，可能会在FSC和SSC分群上并没有针对某些裂解液做特别优化，分群可能未必典型，可根据特异性标记进行设门，只要FSC/SSC未出现明显碎片化或凋亡趋势，就行。

ccx793244586

niwanmao 发表于 2023-3-26 11:13
有些仪器，可能会在FSC和SSC分群上并没有针对某些裂解液做特别优化，分群可能未必典型，可根据特异性标记 ...

感谢倪老师指点！