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[细胞增殖] 求助CFSE检测T细胞增殖应如何设置对照?

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发表于 2022-8-19 13:56:02 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星已解决
本帖最后由 面团胖宝宝 于 2022-8-19 15:02 编辑

我做的是通过免疫磁珠分选出人外周血的CD8+T细胞,通过CD3/CD28激活48h后检测患者和正常人细胞增殖的差异
第一次做CFSE检测增殖,不知道应该如何设置对照呢?
1、空白组
2、CD8单染  
3、CFSE单染
4、经过培养激活,CD8,CFSE染色  
5、未经过培养激活,CD8,CFSE染色
是应该这样设置吗?请大佬赐教!感激!

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终浓度2.5uM是否偏低了点?平时看到比较多的是5uM。 当然,你可以做个梯度最好。 至于细胞数,1×10E6最好,若达不到,只能先试试看,总比做不了好。
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发表于 2022-8-19 13:56:03 | 显示全部楼层
面团胖宝宝 发表于 2022-8-19 14:35
谢谢倪老师,还想请教一下未激活的细胞是也要在培养基中培养72h,只是不加激活剂对吧?因为我这都是同一批 ...

终浓度2.5uM是否偏低了点?平时看到比较多的是5uM。
当然,你可以做个梯度最好。

至于细胞数,1×10E6最好,若达不到,只能先试试看,总比做不了好。
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发表于 2022-8-19 14:27:44 | 显示全部楼层
这个设置已经比较完善了。第一次做可以这样宁可浪费也要求完整的。
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 楼主| 发表于 2022-8-19 14:35:52 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-8-19 14:27
这个设置已经比较完善了。第一次做可以这样宁可浪费也要求完整的。

谢谢倪老师,还想请教一下未激活的细胞是也要在培养基中培养72h,只是不加激活剂对吧?因为我这都是同一批血提的细胞。以下是我设置的protocol,还希望老师能看看给点建议,谢谢!
CFSE检测CD8+T细胞增殖
1、        磁珠分选CD8+T细胞(正常人/患者),37℃预热PBS/0.1%BSA调整细胞浓度至2x10^6/ml
2、        CFSE原液 (10mM):1瓶CFSE加入18μl DMSO溶解,-20℃避光保存
3、        CFSE工作液(5μM):37℃预热的PBS/0.1%BSA将CFSE 原液(10mM)稀释为5μM的工作液
4、        取500μl调整好浓度的单细胞悬液与500ul CFSE工作液混合(终浓度2.5μM),37℃避光孵育10min,每隔一段时间上下颠倒混匀细胞
5、        加入5倍体积含10%FBS的RPMI 1640,在冰上孵育5分钟以终止染色
6、        300g, 5min离心,去上清,PBS洗涤3次,1ml 1640重悬后加入24孔板,加入25ul CD3/CD28激活剂,培养72h
7、        收获细胞,300g离心5min,去上清,buffer洗涤2次,加100ul buffer重悬,加入anti-CD8-APC 5μl,4℃避光孵育30min
8、        1ml buffer重悬,洗涤2次,最后用500μl buffer重悬,300目尼龙网过滤后上机
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 楼主| 发表于 2022-8-19 14:42:01 | 显示全部楼层
本帖最后由 面团胖宝宝 于 2022-8-19 15:04 编辑
niwanmao 发表于 2022-8-19 14:27
这个设置已经比较完善了。第一次做可以这样宁可浪费也要求完整的。

对了老师,做CFSE一管5x10^5个细胞会不会少呢?细胞不够多可能1管达不到1x10^6
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 楼主| 发表于 2022-8-20 16:04:14 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-8-20 08:44
终浓度2.5uM是否偏低了点?平时看到比较多的是5uM。
当然,你可以做个梯度最好。

嗯嗯我试一下,谢谢倪老师解答!
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