请教DC激活实验流程及流式上机

yinxl2017

请问站里大神有关DC激活的问题，先罗列下我的流程和配图：抗体用的thermo的FITC:HumanHematopoietic Lineage Antibody Cocktail( CD2 (RPA-2.10), CD3 (OKT3), CD14 (61D3), CD16 (CB16), CD19 (HIB19), CD56 (TULY56), CD235a (HIR2).); PE: HLA-DRMonoclonal Antibody (LN3); APC: CD86; CD83; CD197 (CCR7).
实验流程简述：第一天：每管77μL血+LPS/肝素/...孵育37℃/5%CO2,孵育过夜；第二天：加入抗体孵育30min,然后破红，室温暗处放置10min，洗涤2次，再加入100μL洗液，混匀加入7AAD，室温10分钟，多聚甲醛固定30分钟，上机。

上机流程：
首先圈定第一个门，G1=R1（图1）. 第二利用空白管（图2）圈定7AAD阴性和阳性群（图3）G2=R2 and R1；第三因为FITC是cocktail，所以同样根据空白管阴选（图4），圈定FITC阴性细胞群，G3=R3and G2；第四根据同型对照圈定PE阳性群（图5），G4= R4and G3.；第五同样根据APC的同型对照圈定APC的阳性群（图6），G5=R5and G4。计算公式：R5 of R4 = R5/R4*100.
后续新的实验考虑固定后细胞都死了，所以去掉了染7AAD这一步，门的设置也是去掉7AAD。
以上是这个实验大致的整体流程。下面有几个问题想请教倪老师和站内的各位大佬：
1. 整体实验流程有什么问题吗？是不是应该先破红再加抗体孵育？
2. 上机流程中有没有哪些设置错的地方？尤其是门策略对不对？
3. 有关抗体：我们选择的这几个marker合理吗？FITC是cocktail，按照说明阴选细胞群，阳选的PE（HLA-DR）应该是DC的细胞群，而染了APC（CD86; CD83; CD197）的应该是激活的细胞，这样APC/PE的细胞比例应该就是DC激活比例，这个计算方式对吗？
3+. 接上面的问题，我们用单个APC做过测试，发现CD86染上的DC细胞明显高于其他两个marker，尤其是CD197只有几个DC细胞被标上。想请教各位选的这三个抗体作为激活DC的marker合适吗？FITC、PE、APC中需要更换哪个marker吗？
4. 之前的实验收集的细胞是G1=R1里面的30000细胞（图7）；后面去掉7AAD后，感觉是不是应该收集初筛的DC细胞群，这样DC细胞会多一些。所以改成了G2=R2 and R1（FITC阴选的细胞群）（收集细胞：30000）。收集后的细胞有个问题，同一次实验同一个人的外周血，同样的处理条件，可是有些管的DC细胞数量在3000-4000左右，有些只有1000。造成这样的原因是什么？外周血加的体积是一样的。

niwanmao

染色，一般还是建议先孵育抗体，再裂红，效果会更好一些。
至于方案，可参考既往的文献：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4896387/

yinxl2017

niwanmao 发表于 2022-10-11 21:13
染色，一般还是建议先孵育抗体，再裂红，效果会更好一些。
至于方案，可参考既往的文献：https://www.ncbi. ...

感谢倪老师的回复，您提到的这篇文献，我之前看过。不过我们做的和它还不一样，他是分离纯化后的DC细胞，我们直接用外周血做的。之前也看了站内您发的其他资料包括一些文献，但发现有关DC的marker是在太多了。所以综合了下，选了一个公司FITC的cocktail的阴选，包括：CD2- CD3-CD14-CD16-CD19-CD56 (TULY56)-CD235a；PE选的HLA-DR+；APC是CD86+CD83+CD197+，不知道这种方案是否合适？需要再增加或者去掉哪种抗体吗？再有想请教倪老师，我们上述各个门的设置有没有什么问题？麻烦倪老师了

niwanmao

yinxl2017 发表于 2022-10-12 08:54
感谢倪老师的回复，您提到的这篇文献，我之前看过。不过我们做的和它还不一样，他是分离纯化后的DC细胞， ...

一般刺激的话，全血似乎变数会比较大。如有可能，尽量是提出来刺激。
设门应该还行，但是最后一个门的位置需要根据分群情况微调。

yinxl2017

niwanmao 发表于 2022-10-12 16:30
一般刺激的话，全血似乎变数会比较大。如有可能，尽量是提出来刺激。
设门应该还行，但是最后一个门的位 ...

好的谢谢倪老师！倪老师，有关最后一个根据分群微调，我的理解是，用了同型、空白调整了门，如果在后续分析时发现，从阴性对照开始，门的位置却不合适，这样我是不是就得再根据阴性对照来微调这个门？因为我确实遇到过这种问题，根据空白，同型调整了，但发现这个门不合适，然后根据纯阴性对照来调整，却能在后续一些组中得到有意义的结果。就只是根据阴性对照把一群细胞排除在门之外。倪老师我这样调有什么问题吗？

yinxl2017

可能我表述的不是很清楚，我用实际实验来描述下：我的分组是：LPS阴性组；LPS阳性组；PF4组（可以理解为实验阴性组）；肝素+PF4组（实验阳性组）；其他药物组；我的目的是想分析其他药物组之间会不会有差异，但理论上肝素+PF4这一组是阳性率最高的，PF4这一组最低。LPS只是作为技术参照，证明实验流程没问题。现在问题是根据空白、同型我把APC的门调整到了图1的位置，这样的结果没有意义。但是如果我根据LPS阴性组将门调整到图2的位置，所有结果就有趋势了，同型对照调整门时没有图1门位置后面那一群细胞；我怀疑这群细胞干扰我的结果，倪老师，我能不能根据LPS阴性来微调这个门？