提取PBMC计数内皮祖细胞 问题多多

ganlimi

ganlimi

       用sigma1077淋巴细胞分离液，提取单个核细胞后，调整细胞密度至10（6）/ml，然后取50ul细胞悬液放入两个上机管中，加入抗体和同型对照。因为分离时有少量红细胞，加了贝克曼的溶血素，这次左上角上很多碎片，老师说是凋亡细胞，但是不应该跟溶血素有关。而且淋巴细胞上面有团东西，老师认为是粒细胞，但是镜下粒细胞不多。
我想问下：1.到底什么原因导致碎片那么多？是免疫组化用PBS不可以用于细胞吗？还是分离液不好，或者溶血素导致细胞凋亡，所以左上角很多碎片。或是没有在超净台上工作，滴灌没有泡酸消毒？
                   2.淋巴细胞上面那团是粒细胞吗？
                  3.为什么同型对照那么非特异？本来刚开始是加了做补偿的管子，但是老师说表达太低了，做不了补偿。
那些同型对照图上靠右边的信号，是因为没有做补偿吗？CD34  VEGVR-2 是BD公司的，CD133是美天妮的。
                  

niwanmao

ganlimi 发表于 2011-8-5 22:02

                               
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用sigma1077淋巴细胞分离液，提取单个核细胞后，调整细胞密度至10（6）/ml，然后取50ul细胞悬液放入 ...

1、导致碎片的原因很多，可能跟提取有关，也可能跟裂解时间过长、裂解液本身变质等有关，与你描述的其它因素无关，这需要你不断的摸索。我个人认为对于这类比例少的细胞，最好用全血法，不要先提PBMC。先标抗体，再裂解红细胞。
2、淋巴细胞右上那群？那群可能是单核细胞。粒细胞基本上都被FICOLL液去掉了。
3、同型对照不是挺好的，这么一点点非特异性荧光很正常。

chujindong

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倪老师说的用全血是可以做的，我做过，挺好的。同意倪老师观点，淋巴细胞右上的不像是粒细胞。圈一下那群细胞看看量有多少。

chujindong

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倪老师看这些同型对照的门是不是可以设得大一点？

niwanmao

chujindong 发表于 2011-8-6 11:47

                               
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倪老师看这些同型对照的门是不是可以设得大一点？

我个人感觉不需要。你们觉得呢？

ganlimi

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为什么表达低的细胞用全血法做更好呢？请问谁有用全血法做内皮祖的图啊？
同型对照双阳的表达比抗体本身高多了，例如PE-mouseIgG1/FITC-IgG1双阳表达率是 4.78%，而PE-VEGFR-2/FITC-CD34 0.73%.请问倪老师，这个数据可以用吗？
为了降低碎片，是不是可以宁愿不把白膜层吸干净，也不要吸那么多分离液和血浆？另外，既然碎片多，淋巴细胞上面那群会不会是不小心吸了上来的粒细胞。如果是单核细胞的话，光看大小感觉跟淋巴细胞的比例不太对。

ganlimi

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谢谢倪老师的指点！
:)

niwanmao

ganlimi 发表于 2011-8-8 22:45

                               
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为什么表达低的细胞用全血法做更好呢？请问谁有用全血法做内皮祖的图啊？

1、无论目的细胞的比例高低，在你提取PBMC的时候都容易丢失，因为你不能确保他没有混在红细胞或者血清那一层，或者即使在白膜层，也有可能刚好没吸到。只是比例高的目的细胞即使丢失少量也不影响结果，而比例低的细胞丢失一点就不行了。用全血法可以尽可能保留这些细胞。
2、你这个同型对照之所以比例比检测组高，是因为右上角那小群非特异性染色的影响，你可以通过反设门，看看这小群细胞在那个区域，将它排除掉。

ganlimi

请问谁有BD的溶血素借我啊？我已经订货了，但是还要等一个月啊。实验紧迫。哎。