各位老师，小鼠肠固有层细胞的数量很少，怎么改善？

晓翰龍卿

根据文献的protocol，提取了几次肠固有层细胞，但是数量还是很少。不知道原因在哪里。请做过的老师，看看细节。谢谢
@niwanmao @Climber
（1）取小肠，剪去派伊尔氏结，纵向切开，刮掉粘液，清洁粪便，剪成1-2CM长度的组织。
（2）加入分离液：将肠组织片段移入50 ml离心管中，加入5 ml分离液，置于恒温振荡箱中，于37℃下震荡(220 r／min)15 min；置于旋涡混合器上，涡旋30 S，将肠组织片段通过100 um滤网。
（3）将肠组织片段重新移入50 ml离心管中，加入5 ml分离液，重复上述震荡、涡旋和过滤步骤 。

（4）PBS洗涤3次去除EDTA
（5）消化：将肠组织片段剪成1mm的碎片，移入新的50 ml离心管中，加入5 ml消化液，置于恒温振荡箱中，于37。C下震荡(220 r／min)45 min；置于旋涡混合器上，涡旋30 S，将肠组织片段通过100um尼龙滤网过滤，收集滤液于15ml离心管中，于4℃下离心(400×g)10 min，弃去上清液，此时沉淀包含LPL。
（6）percoll：将80％等渗Percoll溶液4 ml铺于新的15 m1离心管底部；用40％等渗Percoil溶液8 ml重悬上述沉淀，充分吹打均匀后铺在80％等渗Percoll溶液上，将离心管倾斜180度使液体缓慢沿着管壁加入，两层液体间可见清晰的分界面；在18℃下行零加减速密度梯度离心(1000×g)20min；弃去上层液体至剩余体积为7 ml，吸出两层界面间的不透明细胞层，移入新的15 ml离心管中，加入PBS至体积为15 ml，充分混匀后，于4℃下离心(350×g)8 min，弃去上清液，用5 ml含10％胎牛血清的RMPI 1640培养液重悬沉淀，充分吹打均匀制备细胞悬液。


分离液：每 10 ml PBS 缓冲液加 1 mM DTT(10 ul) 和5 mM EDTA (pH 8.0)（100 μl EDTA母液），10 mM HEPES (pH 8.0) (100 ul)混匀


消化液：含200 U/mlCollagenaseVIII ， 0.15 mg/ml DNase I 的 10% FBS 的 RPMI 1640

Climber

非常抱歉 我们几乎不做肠道的IEL和LPL，STAR protocols 有详细的方案（在附件中） 希望对你有帮助

niwanmao

首先，保证组织样本的新鲜，其次你尝试一下去掉第6步，改为直接机械解离（一定要快速，争取1分钟内）完通过300目尼龙滤网过滤。

晓翰龍卿

niwanmao 发表于 2022-10-15 09:09
首先，保证组织样本的新鲜，其次你尝试一下去掉第6步，改为直接机械解离（一定要快速，争取1分钟内）完通过 ...

谢谢倪老师，第六步不是percoll吗？机械解离是怎么操作的？

晓翰龍卿

Climber 发表于 2022-10-14 17:06
非常抱歉 我们几乎不做肠道的IEL和LPL，STAR protocols 有详细的方案（在附件中） 希望对你有帮助 ...

谢谢老师的回答，我马上学习一下。

niwanmao

晓翰龍卿 发表于 2022-10-18 14:26
谢谢倪老师，第六步不是percoll吗？机械解离是怎么操作的？

Percoll提取，可能丢失了细胞。机械解离有美天旎的酶+仪器，便宜的就是我们网站的魔滤+魔杵。