PBMC刺激剂选择

ChenXinghui

各位老师，我想检测PBMC中淋巴细胞的细胞周期，用的周期试剂盒是cytognos的DNA Labeling Solution，请问在收细胞前多久加入刺激剂最好？应该选择哪种刺激剂？PHA吗？刺激剂终浓度多大？如果想要单独观察T细胞的周期变化，可否加入CD45和CD3圈T细胞群，再观察周期结果？
希望各位老师不吝赐教！谢谢！

niwanmao

PMA+离子霉素刺激4小时。

（1）Brefeldin A, 5 mg/ml
用DMSO配制5 mg/ml brefeldin A (Sigma)。分装为20ul一管，–20°C可保存6个月。
（2）Ionomycin, 0.5 mg/ml
用纯乙醇配制0.5 mg/ml ionomycin (Sigma) 。分装为20ul一管，–20°C可保存6个月。
（3）Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 0.1 mg/ml
用DMSO配制0.1 mg/ml PMA (Sigma) 。分装为20ul一管，–20°C可保存6个月。
（4）利用以上三样试剂配制活化淋巴细胞培养基：解冻PMA、Ionomycin、Brefeldin A各一管。向180ul X-VIVO 15培养基中加入20ul 0.1mg/ml PMA（即PMA:培养基＝1:10）。接着向15ml锥形管中加入4ml X-VIVO 15培养基，再加入刚才稀释好的PMA 4ul，再加入8ul 0.5mg/ml Ionomycin、8ul 5mg/ml Brefeldin A。这样配成的活化培养基各成份终浓度分别为PMA 10ng/ml、Ionomycin 1ug/ml、Brefeldin A 10ug/ml。

ChenXinghui

niwanmao 发表于 2022-10-15 14:30
PMA+离子霉素刺激4小时。

（1）Brefeldin A, 5 mg/ml

感谢倪老师！！！
我还有疑问：
X-VIVO 15培养基可否换成RPMI-1640(10%FBS,1%双抗)培养基？我们实验室一直用的是1640。我是准备测处理后培养20h的PBMC周期。是不是应该在培养0h时加入刺激剂？还是在流式检测前4h（即培养16h时）加入刺激剂？

niwanmao

ChenXinghui 发表于 2022-10-15 18:40
感谢倪老师！！！
我还有疑问：
X-VIVO 15培养基可否换成RPMI-1640(10%FBS,1%双抗)培养基？我们实验室一 ...

可以的。

刺激剂是混在培养基里面的，不存在什么时候加的问题。

ChenXinghui

niwanmao 发表于 2022-10-15 18:57
可以的。

刺激剂是混在培养基里面的，不存在什么时候加的问题。

谢谢倪老师！
该刺激剂可否同样用在：流式检测PBMC中Th1 Th2 Th17 Treg细胞相对比值的实验中？

niwanmao

ChenXinghui 发表于 2022-10-15 19:05
谢谢倪老师！
该刺激剂可否同样用在：流式检测PBMC中Th1 Th2 Th17 Treg细胞相对比值的实验中？  ...

Treg不需刺激，Th1/Th2/Th17测胞内因子需要这个刺激。

ChenXinghui

niwanmao 发表于 2022-10-15 19:14
Treg不需刺激，Th1/Th2/Th17测胞内因子需要这个刺激。

好嘞！明白了。万分感谢倪老师！