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发表于 2023-2-27 10:19:18
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以下内容转自知乎（肿瘤浸润免疫细胞提取）
01 肿瘤分离
1. 采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，放置于含有75%酒精的烧杯中，浸泡30s。
2. 左手持镊子，右手持弯剪，沿肿瘤边缘剪下长约1cm的口子，可清晰看见肿瘤附着于皮下，沿着肿瘤边缘轻轻剪开连接处，剥离肿瘤。
3. 将剥离的肿瘤放入100mm的培养皿中，并在室温下加入5-10 ml的HBSS。
注：肿瘤体积一般不超过1000mm3，肿瘤质量在0.6-0.8g之间。
02 制备肿瘤细胞悬液
4. 待所有肿瘤剥离完毕后，将肿瘤转移至1.5ml EP管中，手持弯剪将肿瘤剪碎。
5. 将肿瘤组织悬液转移到50ml离心管中，用适量HBSS冲洗EP管，并将悬浮液转移到离心管中。管中的总体积为45ml。
6. 在管中加入5ml 10×Triple Enzyme Mix，在摇床上以80rpm、37℃的条件消化1-3小时。
7. 消化完毕后，50g，10min离心，收集上清，则为肿瘤细胞悬液。
注：剪刀剪碎肿瘤的标准为，其可被1ml的枪头自由吸取，无阻碍。
10×Triple Enzyme stock solution (100 ml)
在80 ml HBSS中混合1 g Collagenase IV, 100 mg Hyaluronidase和20,000 Units DNase IV，添加HBSS至100ml。使用0.22μm的滤器进行过滤，分装成5ml储存在-20℃，使用前恢复至室温。
03 Percoll分离免疫浸润淋巴细胞
8. 200×g，5min离心上清，加入10ml HBSS重悬，将其转移至15ml离心管中，200g，5min再次离心，用40% percoll重悬细胞。
9. 在新的15ml离心管中提前加入4ml 80%percoll，再用巴氏滴管小心的沿壁将4ml含肿瘤细胞的40% percoll沿壁加在80%percoll的上面。
10. 350g，30min离心（升速=1，降速=0），40% percoll与80% percoll交界处则为免疫细胞。
04 细胞染色
11. 收集细胞，加入10ml PBS 350g，5min离心。
12. 100μl PBS重悬，转移到1.5ml EP管中，进行封闭。
13. 使用相应的抗体，与细胞一起共孵育。
05 上机分析
细胞分析的marker表达：
巨噬细胞：CD45，CD11b，F4/80，CD206 (M2)，CD86 (M1)
MDSC：CD45，CD11b，Ly-6G，Ly-6C
T细胞：CD45，CD3，CD8，CD4
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发表于 2022-10-16 16:33:31
