分选出来的大肠杆菌处理问题

wh21211314

在BD Aria III 仪器上，分选了10万个大肠杆菌于1.5ml离心管中，分选前离心管内是空的，分选完成后里面大概有100微升的液体。之后我对分选的菌进行PCR，想要把目的基因扩增下来，但是没有成功。


想问下大家，是哪个过程出问题了呢？ 分选的操作不符合要求  还是下游PCR出了问题呢？

niwanmao

wh21211314 发表于 2022-10-24 09:28
老师，分选后在上一次机器进行流式分析，含量如何确定呢？ 能不能将分析的菌回收到上样管中，即不浪费分 ...

分析肯定要浪费菌的，所以控制上样的量即可。
含量就是根据你们所指定的Ratio值。

niwanmao

分选和PCR都需要确认一下。你首先直接拿未分选的样本做PCR，如果PCR能P 出来，那么说明PCR条件没问题，就得考虑分选问题了。

wh21211314

niwanmao 发表于 2022-10-22 12:26
分选和PCR都需要确认一下。你首先直接拿未分选的样本做PCR，如果PCR能P 出来，那么说明PCR条件没问题，就得 ...

老师，我这边试了一下，没经过流式分选的菌pcr没问题，所以应该是分选过程出现的问题。

请问老师，分选有没有注意事项呢？回收管应该提前加点buffer吗？或者仪器参数需要调吗？  我是用ratio值进行分选

niwanmao

wh21211314 发表于 2022-10-22 17:34
老师，我这边试了一下，没经过流式分选的菌pcr没问题，所以应该是分选过程出现的问题。

请问老师，分选 ...

具体要注意哪些很难说，从这个结果来看，至少目前是没分选到有效的目标。Ratio这个值是不是之前你提过的需要计算的值？感觉问题是出在这个上面，分析没有问题，但用于分选，仪器是否可以快速根据这个指标确定目标进而将其分选出来？ 这是我有点怀疑的。

有没有什么可以直接的指标来分呢？

wh21211314

niwanmao 发表于 2022-10-23 19:36
具体要注意哪些很难说，从这个结果来看，至少目前是没分选到有效的目标。Ratio这个值是不是之前你提过的 ...

理论上来讲，Ratio值的大小和双荧光通道散点图中的斜率存在关系，即选中Ratio值最大的细胞群体，等同于双荧光散点图中斜率最高或者最低的细胞群体，自己曾经通过反选门的方式试过。所以我认为可能还需要摸索一下如何提高回收效率，以及PCR的具体细节

niwanmao

wh21211314 发表于 2022-10-23 20:57
理论上来讲，Ratio值的大小和双荧光通道散点图中的斜率存在关系，即选中Ratio值最大的细胞群体，等同于双 ...

我建议，分选后，再上一次机获取少量样本，确认是否分选到了目标，以及其含量多少。
如果没分到，说明用这种计算值来分，可能就不太合适了。

wh21211314

niwanmao 发表于 2022-10-24 07:44
我建议，分选后，再上一次机获取少量样本，确认是否分选到了目标，以及其含量多少。
如果没分到，说明用 ...

老师，分选后在上一次机器进行流式分析，含量如何确定呢？ 能不能将分析的菌回收到上样管中，即不浪费分选的菌。

wh21211314

niwanmao 发表于 2022-10-24 09:56
分析肯定要浪费菌的，所以控制上样的量即可。
含量就是根据你们所指定的Ratio值。 ...

好的 谢谢老师