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Veblen

抗PD-1抗体药物的受体占用率测量
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-8477-1-1.html


在这里面我有几点问题：
1. RO管是否也需要加入同型对照排除抗体非特异性结合。
2. TR管应该要加入饱和浓度的JS001药物，才能得到total receptor，但是流程图中也没有。

我不知道我的理解是否正确，麻烦老师参考一下哈。

cator

看RO检测模式，free模式还是Bound模式，临床上很多时候的对照是Pro-dose的样本

Veblen

cator 发表于 2022-10-27 09:33
看RO检测模式，free模式还是Bound模式，临床上很多时候的对照是Pro-dose的样本

对不起，我认为真的没回答我的几个问题，谢谢哈

cator

Veblen 发表于 2022-10-27 11:56
对不起，我认为真的没回答我的几个问题，谢谢哈

更具计算公式则为PD−1 RO bound strategy(%)=(MFI RO Tube/MFI TR Tube)×100可以知道此受体占位实验是使用的Bound模式，其一般是使用抗药抗体来检测，此文章里就是人IgG4抗PD-1抗体，RO管直接加人IgG4抗PD-1抗体来检测，Tr管是需要先孵育过量的PD1抗体后在开始检测，所以流程图不全，应该最上面还有一部TR管37°孵育过量PD1抗体。排除背景或非特异性一般会在加入一管检测，计算公式一般为PD−1 RO bound strategy(%)=(MFI RO Tube-MFI BG Tube）/（MFI TR Tube-MFI BG Tube)×100

Veblen

cator 发表于 2022-10-27 14:24
更具计算公式则为PD−1 RO bound strategy(%)=(MFI RO Tube/MFI TR Tube)×100可以知道此受体占位实 ...

谢谢，这个我完全理解了，和我的想法是一致的。
另，为了排除非特异性结合，能否将同型对照的抗体不连荧光素，直接加到 RO/TR管，这样就不用单独再多做一管去减去背景值了，这样应该可以吧

cator

Veblen 发表于 2022-10-27 18:17
谢谢，这个我完全理解了，和我的想法是一致的。
另，为了排除非特异性结合，能否将同型对照的抗体不连荧 ...

同型对照一般不会的，一般都是另加一管，如果加受体封闭一般是所有管都加

Veblen

cator 发表于 2022-10-28 08:58
同型对照一般不会的，一般都是另加一管，如果加受体封闭一般是所有管都加
...

是的，一般是加Fc Block

Veblen

cator 发表于 2022-10-28 08:58
同型对照一般不会的，一般都是另加一管，如果加受体封闭一般是所有管都加
...

还想请问一下，这篇文章是怎么个测RO% bound strategy的。
原文Human IgG4 anti-PD-1 antibodies (JS001) were evaluated for RO bioanalysis. A 100 μl blood sample was aliquoted into two different tubes labeled as RO tube and total receptor tube (TR tube), respectively. Blood sample in TR tube was incubated with 3 μg of JS001, or human IgG4 isotype control antibody (Biovision, CA, USA) for 30 min at 25◦C. After centrifugation, the harvested blood cells were washed twice and resuspended in phosphate-buffered saline containing 1% fetal bovine serum (pH 7.0). The sample was then incubated with FITC-conjugated mouse anti-human CD3ε (BD Biosciences, CA, USA), PerCP/cy 5.5 anti-human CD8a (Biolegend, CA, USA), mouse anti-human IgG4 pFc’-PE (Southern Biotech, AL, USA) and one of the following antibodies: APC mouse antihuman CD95 antibody, APC mouse anti-human CD69 antibody, APC mouse anti-human HLA-DR antibody,
APC mouse anti-human CD45RO antibody or APC mouse anti-human CD45RA antibody- for an activated T-cell
marker for 30 min at 25◦C.
到底RO管与TR管里是分别怎样加药物和检测抗体的呢，没看懂？
RO管加3ug药物，再加检测抗体？
TR管直接加同型抗体，再加检测抗体？这样不能得到RO啊.....
原文公式为: PD − 1 RObound strategy (%) = (MFIRO Tube/MFITR Tube) × 100

cator

Veblen 发表于 2022-11-1 00:24
还想请问一下，这篇文章是怎么个测RO% bound strategy的。
原文Human IgG4 anti-PD-1 antibodies (JS001) ...

RO tube和TR tube加入的抗体一致，只是TR tube需要加入过量的IgG4抗PD-1抗体，检测流程就是IgG4抗PD-1抗体和细胞上的PD-1结合，IgG4 pFc和IgG4抗PD-1抗体结合，TR tube加入的是过量的IgG4抗PD-1抗体，认为该药物和细胞上PD-1靶点能结合的都已经结合，RO管就是加入不同浓度的IgG4抗PD-1抗体，根据RO/TR来计算不同浓度下的IgG4抗PD-1抗体的占位率

Veblen

cator 发表于 2022-11-1 10:06
RO tube和TR tube加入的抗体一致，只是TR tube需要加入过量的IgG4抗PD-1抗体，检测流程就是IgG4抗PD-1抗 ...

谢谢哈，我可不可以这样理解（IgG4抗PD-1抗体)就是PD-1的抗体，只是这个抗体的免疫球蛋白类型是IgG4;
另外，IgGpFc’是一个抗体，它与(IgG4抗PD-1抗体)的Fc端结合。
是这样的吧？
但是我没看懂文中TR管加入IgG4同型对照抗体是干嘛的，怎么可以测TR?
两个问题，希望分享一下哈～