本帖最后由 wli123 于 2022-11-22 20:48 编辑
倪老师好，各位老师们好，现在我想向大家请教一个困扰了我很久的问题：我要检测人外周血CD4阳性淋巴细胞中的亚群，在确定电压和补偿没问题的情况下，无论用空白对照、同型对照还是FMO对照，还是换机器检测，有一个marker的阳性率就是非常高，CD4阳性门里，FL2(本文描述的问题marker)/FL3双阳群占FL3单阳群接近100%，占CD4阳性群的百分之六七，而文献中正常一般占CD4阳性群的1%以下。
因为不管是空白对照、同型对照还是FMO对照，这个marker的阴性线都是在10左右，如果阳性标本的阴性线划在10左右，这个指标就非常高。如果将10界定为阴性线，阳性标本中的阳性群又能看出两群细胞（在有些文献中，这个marker是有高低表达之分的），如果将10到100之间的这群细胞界定为阴性细胞，这个marker的比例就接近文献中的数据了。可是将此marker的阴性线划在100，该如何解释呢？我找不到依据。还请各位老师指点迷津，万分感谢！
（1）
图1说明：H12.006是同型对照（空白对照跟这类似），H12.007是阳性全染样本。根据同型对照，将阴性线划在10，FL2/FL3双阳的细胞占达到了5.91%（占CD4门），这个数据与文献严重不符，因为文献中一般在1%以内，最多不超过2%。而且所有的样本都如此。
（2）仔细观察，感觉FL2的单阳管和全染管中，如果将10界定为阴性线，在阳性群里是能看出又分了两群细胞的。
（3）
如果将FL2的阴性线提高到100，这个数据跟文献就相符了。但是我找不到可以解释的依据。
（4）我想用倪老师讲的生物学阴性对照试一下。（FL2这个marker只表达在活化的T细胞和少量胸腺细胞中，粒细胞不表达，所以在全染管中圈了粒细胞门看FL2的表达。）发现有些样本貌似可以解释（图4），有些样本就不太合适（图5）
图4：第2个图是粒细胞圈门，感觉把阴性线划在100，第3个图（全染管）淋巴门中的阳性表达率就是正确的。但是有人告诉我说同一marker在不同细胞群的阴性线位置可能不同，不能这样圈门。这样说有道理吗？
图5：这个样本的FL2marke如果将阴性线划在10，阳性率依然非常高。按照粒细胞这样圈门，划到100多一点儿，数据就正确了。但是这个图里，粒细胞的阴性线是不是划得太远了？实际上说它在10多一点点儿的位置也没关系？
我这个实验做了快一年啦，反反复复折腾，不停地调条件、改变细胞提取方法、换机器，最后都没能解决阳性率高的问题。有可能是抗体本身的原因吗（抗体是Biolegend公司的）？恳请老师们帮我分析原因，予以解答！万分感谢，在线急等！
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发表于 2022-11-22 18:46:05
发表于 2022-11-23 12:26:21
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