如何评价Fc阻断的效果？设门要选择什么对照？

niwanmao

流式细胞术利用荧光标记的抗体区分不同细胞亚群。抗体结合的特异性取决于每个抗体克隆的独特可变区，但是，抗体共同具备的Fc片段，却与体内效应功能相关的绝大多数免疫细胞（如B淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、人血小板、肥大细胞和嗜碱性粒细胞）均能相互作用，这些细胞在其表面表达多种Fc受体，因此导致在流式分析中容易出现背景增高或甚至假阳性信号。其中以单核细胞和巨噬细胞尤为显著。

解决方法通常有两种：

1、常见方法是在用荧光素标记的抗体染色之前，先通过使Fc受体饱和达到阻断的效果。比较有效的Fc阻断剂包括：

（1）商品化的Fc Block（25ug/ml或10ug/ml）；

（2）2.5％或10%的人血清或小鼠血清；

（3）100ug/ml的人IgG。

注意，染色缓冲液配方中通常包含的胎牛血清IgG含量太低，达不到足够的阻断Fc受体效果。

2、使用重组抗体（例如Fab片段基因重组抗体）

同型对照（具有不相关特异性的标记抗体）可用于评估Fc阻断方案的有效性。如下图，虚线是未经Fc阻断的同型对照染色，实线是经过Fc阻断之后的同型对照，可见Fc阻断之后，同型对照的荧光明显降低，说明Fc阻断对你的实验是有效果的，在正式实验方案中，就可以用Fc阻断减少这些Fc受体非特异性结合引起的背景。


然而，不建议将同型对照用于设门，设门参照有如下选择：
- 最佳的是生物学阴性对照，就是用同一生物来源的不表达目标抗原的细胞，最好是细胞大小和颗粒度比较接近的（例如CD56可以用B细胞做生物学阴性对照）
- 如果生物学阴性对照无法找到，则可用RNAi或CRISPR技术制备抗原敲除的同种细胞；倘若感觉成本过高并且多色实验中荧光渗漏是主要的背景，则退而求其次用FMO对照。


参考源：
https://www.uth.edu/imm/service-centers/flow-cytometry/fc-block
https://www.bio-rad-antibodies.c ... gical-controls.html

飞翔

同型对照在表面染色时应不应该加呢，有时还有争议，这个就是最好带上吧

毛豆24821

巨噬的背景和假阳真的很高，我们现在还是得从ssc里先区分出淋巴和多核细胞，再去区各个亚群，或者先把巨噬单核粒从CD45+圈出去再画淋巴也会好看一些，加大Fc的量会不会有用？

niwanmao

飞翔 发表于 2022-11-25 07:44
同型对照在表面染色时应不应该加呢，有时还有争议，这个就是最好带上吧

生物学阴性对照，可替代同型对照。这是肯定的。

放同型对照的文献，主要两种可能性：
1、不懂。
2、实在找不到生物学阴性对照，又没办法去制备RNAi或CRISPR技术制备抗原敲除的同种细胞。

Veblen

那对于单染指标的画门，是否可以既加Fc 阻断剂又加上isotype去画门？  这样画门感觉会更准确，是这样的吗？如上图所示