检测胞内抗原时固定/破膜相关问题

dongfangyao

各位好，向大家求助一个问题：

要流式检测一个跨膜蛋白，样本包括人鼠，抗体识别的位点在胞内段，因此选择胞内染色的方法。
看了很多网上的以及各公司试剂盒对应的kit说明书，操作过程都差不多。但综合下来，对于  “室温固定20-30min”这一步有些疑惑：
1.实验室的博后是建议 4℃固定过夜然后抗体孵育再次过夜，使用的kit是“eBioscience™ Foxp3/转录因子染色缓冲液套件 00-5523-00”，kit说明也有提到“小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时”，人样本是否可行并未提及。
2.在本站搜索以往关于固定/破膜的文章，也有提到“甲醛固定2-3h后必需离心去除，否则会导致自发荧光增高”，但对于含抗体的破膜缓冲液过夜染色这一操作并未提及
3.但其它厂家对于固定时长和抗体孵育时间并未严格要求。

想问的是，固定时长应该根据什么来选择，有必要过夜固定么，还是说如果不会增加自发荧光 过夜固定有一定好处？我也想不明白，也没找到过夜固定的好处....

谢谢大家！

niwanmao

固定的时长，还是根据自己要做的胞内、核内标记的结果好坏而定。

室温固定30分钟，是绝大多数成份破膜剂做好理想胞内染色结果的条件，如果对于核内标记，如结果不理想，我们会略有延长。

至于自发荧光，只要涉及到固定，基本上都会增加，至于增加的多还是少，更固定剂的成份有关。