如何用流式检测胞葬作用（Efferocytosis）？

niwanmao

胞葬作用（Efferocytosis）是指吞噬细胞从组织中清除凋亡细胞和凋亡小体的过程，由凋亡细胞释放的炎症介质启动，在解决炎症方面起着关键作用（Doran等人，2020）。

如果没有Efferocytosis，凋亡细胞和凋亡小体可以诱发二次坏死（Doran等人，2020年）。有证据表明，巨噬细胞对凋亡中性粒细胞（PMN）的吞噬功能受损，导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的持续肺部炎症，这是急性肺损伤（ALI）的一种严重形式（Gr´egoire等人，2018）。
Radbel J等人建立了一个ALI模型，通过让小鼠接触臭氧，然后静脉注射脂多糖（LPS）来诱导ALI。由臭氧和LPS诱导的ALI与持续的中性粒细胞增多和常驻肺泡巨噬细胞（AM）的激活有关，是一种有用的ALI的实验模型，可评估常驻AM对肺部PMN的吞噬作用。为此，他们开发了一种比较方便的评估Efferocytosis的流式方法。

整体流程


详细步骤
特定的无病原体C57BL6/J雄性小鼠（12-13周）。

小鼠被安置在过滤器顶部的微型隔离笼中，并保持食物和水的自由供应。臭氧是通过紫外光发生器从氧气中产生的，并与空气混合，如前所述（Francis等人，2020年）。使用光度臭氧分析仪（2B Technologies, Boulder, CO）连续监测室内的臭氧浓度。通过调整紫外光的强度和进入室内的臭氧流速来维持臭氧浓度。小鼠被暴露在臭氧（0.8ppm）或过滤空气中3小时。

用3mg/kg LPS（大肠杆菌O128:B12，Sigma-Aldrich，St. Louis, MO）来诱导内毒素血症，或者用磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为空白对照。（注：虽然单独的臭氧和LPS可以诱导体内的PMN反应（Hollingsworth等人，2007年；Matute-Bello等人，2008年），但使用联合暴露可以最大化这种反应，以便确认流式方法的性能。）

在暴露于臭氧+LPS（实验组）或过滤空气+PBS（对照组）的24小时后，对小鼠进行安乐死。用5毫升冰冷的无菌PBS经右心室原位灌注肺部。通过插入气管向肺部缓慢灌注和抽取1毫升冰冷的无菌PBS（pH值为7.4）同时轻轻按摩组织，收集肺泡灌洗液。

灌洗液离心（300 x g，8分钟，4◦C）后重悬于缓冲液（含有2% v/v 胎牛血清（FBS）和1 μM EDTA的PBS）中。

用1毫升Hybri-Max™裂解缓冲液（Sigma-Aldrich）在室温下裂解小鼠肺泡灌洗液中的红细胞5分钟。

使用MidiMACS®（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）磁分离收集臭氧+LPS暴露小鼠的Ly6G+ PMNs。剩余的Ly6G-细胞，通过EasySep™小鼠CD11b阳性选择试剂盒（Stemcell technologies, Vanouver, Canada），分出CD11b- 肺泡巨噬细胞（AM）。

使用台盼蓝染料拒染法计数活细胞和纯度。Ly6G+细胞为92.7±4.0%的PMNs；CD11b-细胞为95.3±2.0%的AM（平均值±SE，n=3次实验）。

分离好立即用Annexin V/ PI染色确认中性粒细胞的凋亡情况：


用2μM PKH26或5μM D12730（Molecular Probes, Eugene, OR）标记PMNs（二选一即可）。

后面，是评估Efferocytosis的重要步骤，在无菌无涂层的Nunc™24孔培养板中，在37◦C下将常驻AMs（CD11b-）与标记的PMNs共同培养90分钟，PMN:AM的比例为5：1、3：1和1：1，培养条件为含10% v/v FBS和1% v/v青霉素/链霉素的DMEM/Nutrient Mixture F-12（无酚红）。

共培养完成后，用1ml预冷生理盐水清洗培养板5次，收集细胞。用PBS清洗细胞，离心（300×g，8分钟，4◦C），然后用PBS再洗涤一次，以去除非吞噬物质；然后上机获取或用3%多聚甲醛固定过夜后用荧光显微镜观察。如果PMN染的是PKH26，则用488激发，576±21nm收集PKH26荧光信号；如果PMN染的是D12730，则用640激发，671±30nm收集D12730荧光信号。。作者比较了PMNs和AMs的5:1、3:1和1:1的比例，发现，在5:1的比例下观察到最大的Efferocytosis反应。 由于作者在文章中没有用流式来评估Efferocytosis结果，而是用荧光显微镜，给出直接的图像，但实际上流式也可直接测，具体步骤就是后面要讲的区分发挥Efferocytosis作用的AM亚群：


为了进一步确定发挥Efferocytosis的AM亚群特征，将CD11b-AMs和PMNs在37◦C和4◦C（4℃是Efferocytosis的阴性对照）共同培养90分钟，然后收集细胞，以100μl的染色缓冲液（PBS，2%FBS和0.02%的叠氮钠）重悬，用抗小鼠CD16/32（1:100；克隆93；Biolegend）阻断非特异性结合，然后加入FITC CD11b（1:100；克隆M1/70；Biolegend）、PE-Siglec F（1:10；克隆ES2210D8；Miltenyi）、PE-Viol770-CD45（1:50；克隆30F11；Miltenyi），Brilliant Violet 421-CD11c（1:100；克隆N418；Biolegend）和ViolGreen Gr-1（Ly6G，1:50；克隆REA810；Miltenyi）抗体孵育15分钟，接着用染色缓冲液洗涤细胞，上机获取，可见Resident AM明显是Efferocytosis的主力：


Radbel J, Meshanni JA, Gardner CR, Le-Hoang T, Cervelli J, Laskin JD, Gow AJ, Laskin DL. Novel method to assess resident alveolar macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils by flow cytometry. Toxicol Appl Pharmacol. 2022 Dec 21:116359. doi: 10.1016/j.taap.2022.116359. Epub ahead of print. PMID: 36565939.