抗体染色百分之九十五阳性

wmj123456

倪老师，请问下，做的一个胞质表达的指标，单染，根据抗体说明书建议，用foxp3的固定破膜剂。抗体用量直接按照说明书建议的。但是结果发现抗体的阳性率几乎是百分之百。同时也做了一管阴性细胞的单染，即不表达这个抗原的细胞，也是出现了强阳性，请问可能是哪个方面的原因呢？
如果是抗体滴定没有做好，但是我了解的是，抗体用量不合适产生的非特异性染色，也会出现阴性细胞群的，但是目前用阴性和确定表达的阳性细胞，染色后的结果都是阳性，没有看到阴性。设门是用空白对照管来设门的，即只加细胞。

niwanmao

固定破膜剂，基本上都会造成本底荧光增强，所以必须要做好合适的对照。

如果是单染的，你可以用阴性细胞染色结果作为设门参照，如果阴性细胞和阳性细胞的表达水平几乎重叠，说明破膜效率或者抗体性能需要另外验证。

wmj123456

倪老师，您指的破膜效率是什么意思？会不会存在抗体破膜剂里的某些成分跟抗体发生菲特异性的结合？抗体性能是指的抗体质量，还是要做下抗体滴定？

niwanmao

wmj123456 发表于 2023-1-13 09:22
倪老师，您指的破膜效率是什么意思？会不会存在抗体破膜剂里的某些成分跟抗体发生菲特异性的结合？抗体性能 ...

破膜效率，指的是破膜成份打孔是否成功，假如目标结合位点在细胞核内，而该破膜剂对核膜破膜能力不够，可能就导致结合不上去。因为你前面说阴性和阳性样本结果差不多，所以我觉得可能两者都没结合上。

破膜效率，可以用表达较高的核内、胞内标记确认。

固定之后，本身就会产生明显的背景荧光，这个并不是某些成份与抗体发生的非特异性结合。

抗体性能，指的是该抗体是否能够很好的结合目标位点，可以在高影响因子的文献里面，找对应克隆号的抗体，并且尽量找亮度高的荧光素标记。