babl/c小鼠外周血细胞分群异常问题

风萧易水

我用的是biosharp的红细胞裂解液，处理步骤如下：
1.小鼠眼眶取血大于50μL，先放在抗凝管。
2.从抗凝管取50μL血液加入到1.5mL EP管中，加入1mL红细胞裂解液，室温避光裂解5min。
3.400g离心5min，弃上清，随后加入500μL PBS上机检测，分群如下图所示。

问题是淋巴细胞占比很少，粒细胞太多了，请问这是什么问题？

nikeyia10

左下角的碎片太多了，建议加大FSC阈值

风萧易水

nikeyia10 发表于 2023-2-2 14:58
左下角的碎片太多了，建议加大FSC阈值

非常感谢，改变阈值后分群和比例明显很多了

风萧易水

nikeyia10 发表于 2023-2-2 14:58
左下角的碎片太多了，建议加大FSC阈值

昨天我取了小鼠外周血，设置了不同阈值，看看对淋巴细胞、单核、粒细胞的比例影响，发现阈值越大，红细胞越少，淋巴细胞、单核和粒细胞的比列都会增加。
我在网上找了个参考，淋巴细胞应该在50%~80%之间，单核2~3%，粒细胞8%左右，但是如果我为了满足淋巴细胞的比例而去增大阈值的话，单核和粒细胞的比例就会超出范围，这个是怎么回事？

nikeyia10

风萧易水 发表于 2023-2-3 11:19
昨天我取了小鼠外周血，设置了不同阈值，看看对淋巴细胞、单核、粒细胞的比例影响，发现阈值越大，红细胞 ...

“淋巴细胞应该在50%~80%之间，单核2~3%，粒细胞8%左右”这些是你圈中白细胞之后的相对比，而不是FSC-SSC图中显示的在All events中的比例，阈值的话，就图中来看我个人觉得第4张图比较合适，不能把碎片全切掉，留一点以免切到淋巴细胞群，个人看法仅供参考

风萧易水

nikeyia10 发表于 2023-2-3 11:35
“淋巴细胞应该在50%~80%之间，单核2~3%，粒细胞8%左右”这些是你圈中白细胞之后的相对比，而不是FSC-SSC ...

谢谢回答，就淋巴细胞和粒细胞的相对比例来看，淋巴/粒细胞应该在6~10倍之间，第4张图确实看起来好一点，但是对应比例的话，图中大约是2.5倍，或者说我粒细胞圈门有问题。

Climber

关于血细胞分群设置阈值，还有一个方案是染一个CD45，FSC的threshold不要设得太大，然后增加一点点CD45的threshold，这样图会分成典型的三群，图例是B6小鼠血液增加CD45后的效果

风萧易水

Climber 发表于 2023-2-4 09:19
关于血细胞分群设置阈值，还有一个方案是染一个CD45，FSC的threshold不要设得太大，然后增加一点点CD45的th ...

您的意思是CD45染色前后，FSC-SSC图会有不同吗？而且是染了之后FSC-SSC图分群更明显吗？

Climber

风萧易水 发表于 2023-2-4 14:02
您的意思是CD45染色前后，FSC-SSC图会有不同吗？而且是染了之后FSC-SSC图分群更明显吗？ ...

我们的目的是通过引入CD45的threshold来去除红细胞及碎片