流式细胞仪的多色原理

ppaa

小白一个，看到不同的激光器的滤光片有相同的，比较疑惑，但查到资料发现这些激光器并不是在同一光路上，而是空间上分开的，这样就可以做到不会相互干扰，但此时会有一个问题，因为存在空间上的距离，不同的激光是在不同的时间打在细胞上的，怎么把不同的激光的荧光数据整合到一个细胞上呢？会不会出现有错位的情况呢？有哪位大佬能够解决一下困惑，谢谢！

niwanmao

因为是单细胞排列通过，所以这个时差，计算机会控制好关联的。

ppaa

niwanmao 发表于 2023-3-3 10:06
因为是单细胞排列通过，所以这个时差，计算机会控制好关联的。

我觉得奇怪的是，因为是短波长用于前散射和侧散射的，那长波长的激光如果没有检测到荧光信号，那他怎么知道是有细胞通过了呢？1982年的一篇文献里就讲到了这个方法，真是厉害。

niwanmao

ppaa 发表于 2023-3-3 10:21
我觉得奇怪的是，因为是短波长用于前散射和侧散射的，那长波长的激光如果没有检测到荧光信号，那他怎么知 ...

因为单细胞通过是可控的、可预测的，所以你所担心的，都不是问题。

也正是如此，所以低速的结果CV会更好一些。


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ppaa

niwanmao 发表于 2023-3-3 15:06
因为单细胞通过是可控的、可预测的，所以你所担心的，都不是问题。

也正是如此，所以低速的结果CV会更好 ...

多谢版大答疑

myy559

从理论上来说，不同激光照射到同一个细胞在时间上确实存在这样一个“延迟”，但是这个“延迟”是可以被软件or仪器计算出来，从而可以将不同激光产生的信号统计到同一个细胞上。

丹丹Lisa

ppaa 发表于 2023-3-3 10:21
我觉得奇怪的是，因为是短波长用于前散射和侧散射的，那长波长的激光如果没有检测到荧光信号，那他怎么知 ...

有无细胞通过，是通过前向散射光信号FSC和侧向散射光信号SSC来鉴别的，散射光信号是激光打在细胞上发生偏转产生的信号，FSC在激光的方向上接收，和细胞大小有关；SSC在与激光垂直的方向上接收，和细胞形态和内部物颗粒度有关；它们都属于细胞本身固有的信号，和有无荧光信号没有关系。一般用488nm激光器来激发FSC和SSC。

liuqi

myy559 发表于 2023-3-8 17:04
从理论上来说，不同激光照射到同一个细胞在时间上确实存在这样一个“延迟”，但是这个“延迟”是可以被软件 ...

我觉得可能是时间上的延迟差异来区分不同的激光器光信号，比如PE-CY7是488激发，APC-CY7是638激发，发射光谱都是远红外区共一个780±30滤光片接收，但488激光器在0~5ms工作激发，那么0~5ms内780±30滤光片收到的光信号就是488通道的，同理10~15ms内是638激光器工作，那么10~15ms内780±30滤光片收到的光信号就是638通道的；还有一种设计，就是不共用780±30滤光片，两个激光器光路不一样，分别配置两个780±30滤光片，638激光器的光路和488的光路不一样，通过两个互相独立780±30滤光片。好像大部分多激光多色通道流式仪是通过不同激光器的光路设计来实现的，不知道有没有通过时间差异来区分的。

wmj123456

liuqi 发表于 2023-8-30 22:56
我觉得可能是时间上的延迟差异来区分不同的激光器光信号，比如PE-CY7是488激发，APC-CY7是638激发，发射 ...

第二种是不是多一些了？每根激光器激发后的信号，是单独传输，然后对应单独的检测器，所以就能比较好的分开了。另外想请问个问题，如果是有405,488和638三根激光器，细胞依次排列经过，是波长最短的激光405最开始激发的吗？然后是488,638？这个激发顺序是特定的吗？

liuqi

wmj123456 发表于 2023-9-3 14:26
第二种是不是多一些了？每根激光器激发后的信号，是单独传输，然后对应单独的检测器，所以就能比较好的分 ...

我之前的回答可能有点错漏，我接触的几个流式细胞仪品牌的仪器好像都是有“延迟时间”这个指标的，这个参数一般在流式细胞仪进行质控检测的时候会出现，数值有正负，调整这个数值对质控影响很大，一般不会动它。我之前用的贝克曼家的Cytoflex S里面488没有延迟是0，405是负值表示提前，638是正值几十毫秒还是纳秒不记得了，表示延后了，其他家的仪器各激光器具体正负数值就不清楚了。有这个参数的原因是多激光器的激光不会同时打在样本上，互相之间有个时间错位，各色激光光电信号通过“延迟时间”这个参数进行修正，把各自的信息在时间维度上进行计算处理（延后或提前）后回归到同一个检测粒子上。