小鼠Treg的检测问题

毛豆24821

hi 各位战友，
最近一段时间遇到Treg的检测问题，首先小鼠中用foxp3和CD25双阳来标记Treg，foxp3这个marker我们已经接触过好几年了，用的是clone是ebioscience的FJK-16s，不同panel也试过，结果跟panel无关联，固定破膜液也是ebioscience那款，在人，小鼠，猴子中不同组织的表现一直都不错。试剂都是在效期内使用。

遇到的问题归纳如下：
1. 以往的naive Balbc 小鼠中脾脏是有明显Treg，4T1肿瘤模型荷Balbc 小鼠后，检测脾脏一直检测不出Treg，但在同一只小鼠的淋巴结和肿瘤就可以检测到明显Treg，会有可能出现肿瘤和淋巴结有Treg，脾脏没有Treg的情况吗？
2. 重复了四次4T1模型，和3次MC38模型，大部分都是可以检测出明显Treg的。
   但在第四次4T1模型中（LN还是可以检测到，Spleen和Tumor都检测不到了），同一天做的naive Balbc 小鼠中（LN可以检测到，但是spleen也检测不到了）。
   在第2次MC38模型中（Tumor可以检测到，但是Spleen检测不到或者是weak）。
3. 因为CD25的检测一直都表现不错，那就怀疑是Foxp3的问题或者是动物问题，或者我们那台机器问题？或者各位有遇到类似情况吗？为了验证foxp3的clone，我们还尝试了几个别的clone，没找出差别的原因，排除clone影响，请教各位还有什么方面可能会有问题。

4T1小鼠模型的淋巴结：

4T1小鼠模型的淋巴结

4T1小鼠模型的脾脏：

4T1小鼠模型的脾脏

4T1小鼠模型的肿瘤：

4T1小鼠模型的肿瘤

niwanmao

看上去检测应该问题不大，试剂感觉不是问题所在，而是模型的稳定性，是否存在某种影响结果的变异因素？

毛豆24821

niwanmao 发表于 2023-3-26 11:30
看上去检测应该问题不大，试剂感觉不是问题所在，而是模型的稳定性，是否存在某种影响结果的变异因素？ ...

naive小鼠和同种荷瘤小鼠前后结果不一致。小鼠都是普通小鼠，维通利华买的

cym

请问楼主在MC38模型中检测到Treg细胞是解离了多少肿瘤组织呢？我解离150mg肿瘤组织几乎分不出来Treg细胞

niwanmao

毛豆24821 发表于 2023-3-27 09:40
naive小鼠和同种荷瘤小鼠前后结果不一致。小鼠都是普通小鼠，维通利华买的 ...

前面4次4T3和3次MC38，脾脏检测到的Treg，大概比例是多少？如果本身就低，是否可能只是一次波动？

另外，Foxp3的表达可能受到细胞活化、分化、转录调控等因素的影响，导致某些情况下Foxp3+Treg细胞会下调Foxp3表达，从而丧失免疫抑制功能，是否有可能这次的实验中，干预或建模出现了波动？

cym

niwanmao 发表于 2023-3-30 07:44
前面4次4T3和3次MC38，脾脏检测到的Treg，大概比例是多少？如果本身就低，是否可能只是一次波动？

另外 ...

网上查到的Treg大概是占脾脏总细胞的2%。老师，我的MC38荷瘤小鼠倒是能在脾脏和淋巴结检测到不少Treg，而在肿瘤中就算上样细胞数到了50万，仍然只有一两百个Treg，请问是和取材还有分离方式有关系呢？我裂解肿瘤组织后，没有用percoll分离淋巴细胞

niwanmao

cym 发表于 2023-3-30 23:24
网上查到的Treg大概是占脾脏总细胞的2%。老师，我的MC38荷瘤小鼠倒是能在脾脏和淋巴结检测到不少Treg，而 ...

上级门淋巴细胞如果明显的话，我想比例也不会影响如此之大。
不过如果不检测非淋巴细胞的话，用Percoll提取还是会更好一些。

毛豆24821

cym 发表于 2023-3-29 15:34
请问楼主在MC38模型中检测到Treg细胞是解离了多少肿瘤组织呢？我解离150mg肿瘤组织几乎分不出来Treg细胞 ...

一般100MM3以上的肿瘤组织就可以足够流式，我们染色只会铺5million个细胞，上机要求肿瘤收到150-200万，另外肿瘤的部位也很重要，坏死或者病变的部位也没啥有用细胞的。

cym

谢谢楼主的回复！原来上机需要收集这么多细胞，我只收了50万个就停了。取材需不需要找有血管的地方呢？不知道是不是我取的组织没有多少血丝，得到的Treg比例比文献低很多

cym

niwanmao 发表于 2023-3-31 07:24
上级门淋巴细胞如果明显的话，我想比例也不会影响如此之大。
不过如果不检测非淋巴细胞的话，用Percoll提 ...

谢谢老师的建议！我的CD45+细胞有50%，但是再分CD4+细胞的时候只有4.5%了