细胞自发荧光如何产生？如何优化尽量减少其影响？

niwanmao

细胞具有自然水平的荧光，称为自发荧光。
细胞自发荧光可能是由于胶原蛋白和弹性蛋白、环状化合物（如 NADPH 和核黄素）、芳香族氨基酸和细胞器（如线粒体和溶酶体）的存在。 由于产生荧光的这些细胞化合物和细胞器水平的变化，自发荧光水平可能会有所不同。 发出自发荧光的细胞在显微镜下观察时可能会发出微弱的光或雾状。
尽管这是正常的现象，但却是流式细胞术实验中让人抓狂的常见bug之一，会干扰低水平荧光的检测。
更不用说，在细胞活力降低或死亡的时候、在细胞固定和破膜时，自发荧光更是明显增强。


要开发用于常规流式细胞术分析的最佳方案，最大限度地减少背景并最大限度地提高可靠区分阳性和阴性细胞群的能力，去除细胞自发荧光，是必须要做的一个优化环节。

综合目前现有的资料，对于常规流式细胞术，针对自发荧光可优化的几个要点如下：

• 在固定试剂的选择上，由于戊二醛引起的自发荧光强，故甲醛仍是首选（可用0.01% 甲醛中固定细胞 10-15 分钟，然后使用 Triton 或 NP-40（PBS 中 0.1-1%）等破膜（可部分溶解核膜），适用于核抗原染色）。乙醇虽然破膜效果好，样本保存时间长，但自发荧光强，容易影响很多表面位点的检测。
• 在荧光素选择上，尽量使用发射光波长600 nm 以上的荧光素，因为在较长的光波长下自发荧光较少，大多数自发荧光是在较短的光波长下检测到的，在 350-500 nm 处吸收最多，在 350-550 nm 处发射。 对于哺乳动物细胞尤其如此，它们含有许多被 488 nm 激光激发并在 FITC 范围内发射的化合物。另外，使用非常亮的荧光素也可以减少自发荧光的影响。
• 使用适当的对照来确定自发荧光、光谱重叠和不良抗体结合等因素对实验的影响，从而实现准确的分析。
  

更多自发荧光处理方法，参：固定后细胞那烦人的自发荧光，怎么办？

参考文献：
(1) Autofluorescence - Flow Cytometry Guide | Bio-Rad. https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-autofluorescence.html  
(2) Considerations for the control of background fluorescence in clinical .... https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19575390/
(3) Reducing Autofluorescence - University of Virginia School of Medicine. https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/reducing-autofluorescence.pdf
(4) Flow cytometry intracellular staining protocol | Abcam. https://www.abcam.com/protocols/flow-cytometry-intracellular-staining-protocol  
(5) Permeabilization & Fixation - Flow Cytometry Guide | Bio-Rad. https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-fix-and-perm.html  
(6) Blog - Fix Now? Fix Later? - Considerations for the Use of ... - BioLegend. https://www.biolegend.com/en-us/blog/fix-now-fix-later-considerations-for-the-use-of-paraformaldehyde-fixation-in-flow-cytometry  

yxyyjs

这个总结好，果断收藏