鉴定少突胶质前体细胞（OPC）表面标志物 PDGFRa的问题

Price007

关于鉴定少突胶质前体细胞（OPC）表面标志物 PDGFRa的问题

  本人最近在做少突胶质前体细胞的鉴定工作，在检测PDGFRa这个表面marker时发现很多品牌的抗体都染色不上   invitrogen的 CD140a Monoclonal Antibody (APA5), PE, eBioscience™ ，有很多篇文章引用，但是在我们这边根本检测不到任何表达。我们也试过用阳性细胞（U118）去检测表达，发现只有Abcam的重组Anti-PDGFR alpha抗体[EPR22059-270] (ab203491)能够检测出高表达，但是这是一个间标抗体，很不方便  所以想请教一下各位网友，有没有做过相关实验的  知道为什么用直标的抗体鉴定不出来，而间标的却能检测出来 。
我们的检测流程如下：  
1.PBS洗涤一遍    2.加入用1%BSA稀释的抗体4℃孵育30min   3.用PBS洗涤两遍上机  

niwanmao

第2步，用1％BSA稀释的抗体，具体是什么情况？多少ul样本加入多少抗体，为何要用1％BSA稀释？

Price007

niwanmao 发表于 2023-4-18 08:39
第2步，用1％BSA稀释的抗体，具体是什么情况？多少ul样本加入多少抗体，为何要用1％BSA稀释？ ...

我们一般做表面marker的时候 会选择将封闭步骤和染色步骤放在一起   也就是100ul  1%BSA  PBS溶液加入5μl左右抗体。  做其它表面marker没事  就做PDGDFR这个有问题   

niwanmao

Price007 发表于 2023-4-18 20:11
我们一般做表面marker的时候 会选择将封闭步骤和染色步骤放在一起   也就是100ul  1%BSA  PBS溶液加入5μ ...

染色时的总体积还是100ul吗？

间标有时候是会增强，但是真阳还是假阳，我觉得还是需要做间标的FMO对照才能明确。

直标出问题，大多还是在滴度上，可以做一个梯度看看。

Price007

niwanmao 发表于 2023-4-19 08:17
染色时的总体积还是100ul吗？

间标有时候是会增强，但是真阳还是假阳，我觉得还是需要做间标的FMO对照才 ...

总体积是100ul的   好的  后面做个间标的FMO看看  主要是这个抗体的推荐浓度是5ul每1E6细胞  在100ul稀释液里   我们每管细胞大概只有2E6左右  理论上抗体浓度是过量的  

悠游

Price007 发表于 2023-4-19 10:25
总体积是100ul的   好的  后面做个间标的FMO看看  主要是这个抗体的推荐浓度是5ul每1E6细胞  在100ul稀释 ...

每管细胞2E6左右，你们加了多少抗体？5吗？滴定做得怎么样