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发表于 2023-4-21 14:21:13
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并不只是理论上，仪器就是根据这样的原理设计的。这里有两个问题：
1. 多激光仪器大部分都是平行排列，细胞会依次经过多个激光束，由于位置不同，不同激光激发产生的荧光信号可以通过对应的pinhole分别收集，然后经光纤传到独立的一套检测器（PMT等），即不同激光激发产生的荧光信号是分别检测并记录的（如帖子的图所示）。那么如何把多激光激发的信号整合到一个细胞上呢，一般把488蓝激光设为基准（即细胞经过蓝激光时间设为0），由于鞘液流速固定，所以经过其他激光束的时间可以确定，这个时间差就是time delay；假如经过红激光时间为+60 μs，而time delay设置正确，那么仪器中的分析系统会把蓝激光（0 μs）的脉冲信号和红激光（60 μs）的信号整合在一个事件（event)上。另一方面，如果time delay设置不对（比如设置为58 μs），那么仪器会把蓝激光（0 μs）的信号和红激光（58 μs）的信号整合到一起，而实际上在经过蓝激光58 μs后细胞可能还没到红激光，或者只有细胞边缘接触到红激光，58 μs时红激光还没有激发荧光素产生荧光或者产生很弱的荧光；那么我们在分析时就会发现，蓝激光激发的荧光素（PE-Cy7）信号正常，而红激光激发的荧光素（APC-Cy7）信号变弱或无信号。所以，设置正确的time delay值，并保持稳定的鞘液流速，对于多激光流式细胞仪是非常关键的，并不是可有可无的。根据仪器设计，距离蓝激光越远的激光，被其激发产生的荧光信号强度受鞘液流速的影响越大。
2. 至于PE-Cy7和APC-CY7之间有补偿存在，则是因为交叉激发的情况存在，即我们虽然希望PE-Cy7只被蓝激光激发，而APC-CY7只被红激光激发；但是实际情况并不是这样，PE-cy7也能被红激光激发，APC-Cy7也能被蓝激光激发，虽然激发效率比较低。例如一个细胞上同时标记了PE-Cy7和APC-CY7，在这个细胞经过红激光时，不但APC-Cy7能够正常激发，PE-Cy7也能被低效激发，那么混合荧光进入红激光对应的光纤和检测器后，780/60通道检测到的信号实际上是APC-CY7和PE-Cy7两种荧光素被红激光激发产生的荧光，所以必须进行补偿，才能排除PE-Cy7产生的荧光信号。可以想象，如果激光器数量和实验用的荧光素数量进一步增加的话，这种交叉激发的情况会更复杂，所以我们看多色流式实验的补偿矩阵时就会发现，每两个通道之间都有补偿，并不是说不同激光器激发的荧光素之间就不存在补偿。 |
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发表于 2023-4-19 08:15:26
