自噬(Autophagy)的三分类，及其检测方法

niwanmao

自噬是一个高度保守的过程，其中细胞质成分和细胞器被溶酶体降解，从而清除细胞质中功能失调的细胞器和细胞内病原体，并回收细胞质成分。 尽管自噬最初被认为是对饥饿的一种反应，但现在很清楚许多其他应激源可以触发该过程，并且自噬的基础水平是细胞稳态的关键。

自噬被多种刺激上调，包括激素刺激先天免疫信号和生理压力，如能量耗尽或高温。 另一方面，自噬的下调与一系列疾病有关，包括癌症、传染病和神经退行性疾病，并与衰老有关。

存在三种主要的自噬途径，见下图。


微自噬（microautophagy）通过溶酶体膜的内陷将其目标递送至溶酶体，从而能降解少量细胞质内容物。 这个过程知之甚少，可能涉及负责内陷的发动蛋白相关 GTP 酶 Vps1p 和许多自噬相关基因 (Atg) 蛋白质。人们对微自噬知之甚少，因此可用于研究该过程的工具数量有限。 评估微自噬最常用的方法是电子显微镜检查，以寻找在溶酶体膜内陷过程中形成的囊泡。

伴侣介导的自噬 (CMA) 通过跨溶酶体膜的直接易位将细胞质蛋白递送至溶酶体。  KFERQ 样五肽基序通过与胞质 Hsc70 及其伴伴侣相互作用将蛋白质靶向溶酶体。 底物-Hsc70 复合物与溶酶体膜上的 CMA 受体 Lamp-2A 相互作用，导致 Lamp-2A 多聚化形成易位复合物，然后底物在 Hsc70 (lys-Hsc70) 的帮助下展开并转运穿过溶酶体膜。 在溶酶体膜和内腔中发现的三种伴侣蛋白（lys-Hsc70、膜相关 Hsc70 和 lys-Hsp90）似乎专用于 CMA。  Lamp-2A（一种被认为是 CMA 底物受体的膜蛋白）的水平可用于评估 CMA 活性，Lamp-2A 和 Hsc70 的共定位可用于鉴定 CMA 活性溶酶体。 此外，已经设置了几个标准来定义 CMA 底物：

• 存在 KFERQ 样靶向基序；
• 与 lys-Hsc70 阳性溶酶体相关；
• 取决于溶酶体活性的降解率；
• 与胞质 Hsc70 的相互作用；
• 与 Lamp-2A 的胞质结构域相互作用；
• 浓度取决于 Lamp-2A 活性；
• 转移到纯化的溶酶体中的能力。
  

巨自噬（macroautophagy）是研究最多的自噬途径，能降解更大量的细胞质内容物，并由专门的细胞器自噬体介导。 巨自噬始于吞噬泡组装位点 (PAS) 的形成和 Unc51 样激酶 (Ulk) 复合物的组装以启动自噬体形成。 随后是成核阶段，此时 Ulk 复合物与由 beclin-1、Vps15、Vps34 和 Atg14 组成的 III 类 PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。 成核后吞噬泡的膜膨胀，形成自噬体。 在此阶段，Atg12/5/16 复合物募集促进了磷脂酰乙醇胺 (PE) 与 LC3（酵母中的 Atg8）的结合，LC3 是自噬体膜的唯一已知标记。 自噬的几个关键步骤需要 PE-LC3复合体：自噬膜扩张、自噬货物识别和自噬溶酶体形成。 整个过程由 30 多个自噬相关基因（Atg 蛋白）协调，包括 Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白（Lamp-1 和 Lamp-2）和微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3A/  B（MAP1LC3A/B 或 LC3），这些蛋白均是自噬的常见标记物。 在巨自噬的最后一步，完全形成的自噬体与溶酶体融合，进行降解。

评估巨自噬有多种方法：

• 电子显微镜
  透射电子显微镜 (TEM) 仍然是一种非常流行和广泛使用的自噬检测方法。 在自噬过程中形成的结构，例如吞噬细胞和自噬体，可以使用电子显微镜来识别。  TEM 能够通过含有完整胞质溶胶或细胞器的自噬体的存在与自噬晚期定性区分自噬早期阶段，后者的特征是自噬溶酶体具有部分降解的胞质溶胶和细胞器。 然而，这种方法需要有经验的用户能够重复识别和定义这些超微结构特征。 还应注意的是，使用 TEM 进行客观的定量测量非常困难。
• LC3/Atg8 和 p62/SQSTM1
  微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3A/LC3A 和 3B/LC3B (MAP1LC3A/B)，通常缩写为 LC3 或在酵母中称为 Atg8，是自噬体最可靠的标记。
  
  LC3 以无活性胞质形式 (LC3-I) 存在，在自噬过程中通过蛋白水解和脂化作用转化为活性自噬体膜结合 LC3-II。 这可以通过Western blot进行监测较小的 LC3-II 带的出现，或通过免疫荧光或免疫组织化学，定位从细胞质到膜结构重定位的LC3。 在进行这些测定时，应牢记 LC3-II 在自噬体与溶酶体融合后会降解。 在某些情况下，即使自噬活性很高，也会导致低水平的 LC3-II。
  
  通过适当的对照，可以对 LC3-II 斑点进行计数以量化自噬体的数量。由于自噬发生在所有细胞的基础水平，因此应使用 LC3-II 斑点数量的变化而不是具有 LC3-II 斑点的细胞数量的变化来衡量自噬调节。
  
  LC3 抗体和 GFP-LC3 融合蛋白也经常用于通过流式细胞术评估自噬。 尽管自噬导致 LC3-II 浓度增加，但它会导致总 LC3 浓度总体下降，这可以通过流式细胞术进行量化。
  当使用 LC3 作为自噬体形成的指标时，一个重要的考虑因素是 LC3-II 水平的变化是组织和细胞类型特异性的，并非所有自噬相关蛋白在删除时都会阻止 LC3 加工。 当使用蛋白质印迹法量化 LC3-I 处理时，需要加入适当的控制，包括标准化控制，因为一些抗 LC3 抗体对 LC3-I 和 LC3-II 表现出不同的敏感性。 即使在 SDS 样品缓冲液中，LC3-I 也对冻融和降解更敏感。 因此，样品应立即煮沸，不要进行多次冻融循环。
  
  p62 降解是另一种常用的标记物，因为这种蛋白质在多泛素化蛋白质的自噬清除过程中优先通过自噬降解。 应该注意的是，LC3 和 p62 都可以在自噬过程中进行转录调节。 因此，建议用其他自噬措施补充 LC3 和 p62 降解测定。
• lamps、Atg5、Atg14 和 Beclin-1
  针对溶酶体标记物 Lamp-1 和 Lamp-2 或针对吞噬细胞和自噬体标记物（如 Atg5、Atg14 和 Beclin-1）的抗体通常用于通过免疫荧光显微镜、蛋白质印迹和流式细胞术追踪自噬的进展。 溶酶体标记物如 Lamp-2应与其他自噬标记物（如 LC3-II）结合使用以评估自噬。  Atg14 也与 ER 相关，因此它也只能与其他自噬标记物结合使用。  Beclin-1 斑点可用作自噬诱导的标志物，但不存在于不依赖Beclin-1的自噬中。
• Cathepsin activity
  荧光素偶联的Cathepsin底物可用于通过报告Cathepsin B、K 和 L 蛋白酶活性的存在来鉴定活细胞中的溶酶体。 这些可渗透细胞的无毒试剂被添加到细胞中，并在Cathepsin存在的情况下裂解产生荧光产物。 当与 Hoechst 和溶酶体等核染料以及吖啶橙等细胞器标记物结合使用时，可以评估自噬水平。
• 评估autophagic flux
  因为自噬是一个动态过程，所以评估autophagic flux会比单纯评估自噬体数量更能反映此过程。
  
  可以使用多种测定法检测autophagic flux。 通过比较不同条件下或不同样本中的 LC3-II生成，可估计 LC3-II 更新率。
  自噬小体向自溶酶体的成熟可以通过利用GFP在酸性溶酶体环境中淬灭来量化。 RFP-GFP-LC3 融合，自噬体呈现黄色，而自溶酶体由于 GFP 荧光淬灭而呈现红色。
  也可通过长寿命蛋白质的同位素标记，跟踪整个过程。
  

在研究自噬时，重要的是要考虑自噬和细胞凋亡之间存在显著的标记重叠，例如，组织蛋白酶和 Beclin-1 也与介导细胞凋亡有关。 因此，建议在评估自噬时使用多种标记物，以避免错误的结论。


下表概括了前述内容，供参考

自噬特征	检测方法或标记	方法
Phagophore	Atg proteins, Beclin-1, electron microscopy	Western blotting, flow cytometry, fluorescence
Autophagosome	LC3-II antibodies; GFP-LC3 fusions; electron microscopy	Western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy
Autolysosome	Electron microscopy, RFP-GFP-LC3 fusions, cathepsin assays, Lamp-1 and Lamp-2	Western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy
Autophagic flux	RFP-GFP-LC3 fusions; fluorogenic protease substrates; isotopic labeling; p62/SQTSM1 turnover	Western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, radioisotope detection

信源：https://www.bioradiations.com/assessing-cell-health-autophagy/