MLN冻存后复苏的流式染色

liaomin

老师和各位兄弟姐妹们大家好，我之前由于实验原因，将小鼠肠系膜淋巴结细胞制备成单个细胞悬液后，用冻存液冻存起来了（冻存液配方是50% 1604培养基+40% FBS+10%DMSO,这是实验室之前试过的没有问题的冻存液配方），但是现在将细胞复苏染流式（只是表面染色，染了CD4,CD8等T细胞marker)，发现效应趋势跟之前用新鲜组织做的完全不一样，没有了效应。我的具体复苏和染色方案如下：

1、  取出冻存管，37度水浴解冻；

2、  在15ml离心管中加入10ml预热至37℃的PBS；

3、  用移液管将将冻存管中的细胞转移至含PBS的15ml离心管中；

4、  常温，500g×10分钟；

5、  用完全培养基重悬细胞，将细胞放置于37度培养箱中孵育1h；

6、  取200ul细胞至流式管中，加入1ml PBS，300g，离心5min；

7、  弃上清，加入流式抗体染液50ul，室温避光孵育20min；

8、  孵育结束后，加入1ml PBS，300g，离心5min；

9、  弃上清，加入50ul PBS重悬，上机。

烦请各位大神指点，请问我这个是哪些方面存在问题，应如何改进呢？万分感谢！！！

niwanmao

这个冻存液配方以前是用于冻存什么标本来着？

因为检测目标是淋巴细胞，所以我在想，是不是用90% FBS和10%无菌DMSO的配方冻存会更好？

另外，我不知道你所说的“没有了效应”指的是什么？这里的图只放了CD4、CD8亚群的分群，并没有做效应T细胞的指标。

悠游

冻存后复苏的细胞做流式染色的话，还是推荐增加死活染料吧，不然死细胞可能会干扰结果；
而且37度孵育1小时后是直接取的上清吗？

liaomin

老师您好，这个冻存液的配方是他们以前冻存所有标本的配方，我下次可以试试90%+10%无菌DMSO的冻存液配方。老师我说的效应不是指T细胞的效应细胞，是指某个基因对淋巴细胞的数量和功能的影响。我用新鲜标本的时候，该基因能够对T细胞的数量有影响，但是冻存后复苏的样品中，这个影响没有体现出来。

liaomin

悠游 发表于 2023-4-26 09:02
冻存后复苏的细胞做流式染色的话，还是推荐增加死活染料吧，不然死细胞可能会干扰结果；
而且37度孵育1小时 ...

好的，非常感谢您的回答，我下次加个死活试试。孵育之后是重悬混匀之后再取的细胞。