冻存的PBMC能用于流式检测吗？什么冻存和复苏条件最好？

niwanmao

PBMC提取出来之后，可冻存起来，后续集中进行流式检测，但是主要是限于适应性免疫更多见，在Cytometry杂志的OMIP系列中，经常可看到。
那么，如何冻存，如何复苏呢？这可能会影响到PBMC的活力。
冻存
首先，用Ficoll或Percoll提取PBMC，然后，使用无菌玻璃吸管转移到装有tris-buffered (pH 7.5) saline solution(BSS)的15mL管中，然后在20˚C下再次以500g离心PBMC 10分钟，去上清。随后，将PBMC重悬于AB型血供者的4 mL 热灭活人血清（heat-inactivated human serum pool，HSP），在4˚C下储存10分钟。
接着，制备冻存培养基，每4ml包括3.2 mL不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640和0.8 mL二甲基亚砜。将4˚C冻存培养基滴加到前述重悬在HSP的PBMC中，二甲基亚砜的最终浓度为10%。
然后，将冻存管直接放置在-80˚C冰箱的架子上，可保存2周。如果需更长保存时间，则需进行程序化降温，逐步保存到液氮。

复苏
丹麦的Hønge BL等人通过测量细胞活力和绝对活PBMC计数，系统地评估了PBMC解冻过程中的七个步骤，见下图，各个步骤中均对比了不同方式：


结果发现，活PBMC数量在很大程度上取决于洗涤液的成份和温度、离心力、离心持续时间和孵育持续时间，相反，并没有发现改变解冻时间、PBMC和洗涤液的混合方法、离心温度等条件的影响。
其中，效果最好的洗涤液成份是含20%胎牛血清的RPMI 1640，37°C洗涤。当在 15 mL Falcon 管中使用 10 mL 洗涤液时，样本应以 500 g 离心至少 10 分钟。PBMC 可在 37°C 5% CO2 培养箱中孵育（静置）长达8小时而不影响活细胞数量，但孵育 16 小时会显著降低存活率和回收率。

信源：Hønge BL, Petersen MS, Olesen R, Møller BK, Erikstrup C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLoS One. 2017 Nov 1;12(11):e0187440. doi: 10.1371/journal.pone.0187440. PMID: 29091947; PMCID: PMC5665600.