求助：凋亡图里老出现类似直线的细胞群？

Zoravae · 发表于 2023-5-3 20:27:26

求助：实验小白之大大的疑惑
做了几次凋亡实验，发现图里老出现类似直线的细胞群，调了光补偿，还是有，怎么办？
使用的流式是BD C6厂家的。
步骤：加药2h后，弃掉培养液，PBS洗细胞，无EDTA胰酶消化细胞，1000转5min离心，洗离心重复三遍。用FITC和PI染15min后上机。
问题有：
1.图1-2中梯度加药后有俩个细胞群，且随着给药量加大，左上的类似直线的细胞群越多，但右上（晚凋）和右下（早凋）不多。
2.加了药为什么早凋很少？是时间还不够吗？
3.BD C6这个仪器怎样调光补偿？
4.如何划十字门？
5.用BD C6这种仪器，不要调压强的，是不是不用做恐空白组，只需要做单染（用来调光补偿）和双染的？

niwanmao · 发表于 2023-5-4 08:37:47

有没有用专门的缓冲液重悬？Annexin V FITC需要专门的缓冲液染色。

Zoravae · 发表于 2023-5-4 21:45:40

用了，买的是10*的，用PBS稀释成1*的用的。

Zoravae · 发表于 2023-5-4 21:47:38

用的是这个厂家的试剂做的凋亡实验

niwanmao · 发表于 2023-5-5 08:06:50

Zoravae 发表于 2023-5-4 21:45
用了，买的是10*的，用PBS稀释成1*的用的。

如确定染色步骤没问题，可能是药物无法有效诱导凋亡。想办法用CCCP之类的药物诱导一个阳性对照，确保实验有阳性对照。

wxd · 发表于 2023-5-5 08:23:55

不知道你用的是什么种类的细胞，但是我们作为一家实验外包公司，做细胞毒性实验，一般用1-5% DMSO处理24 h作为阳性对照。另外用C6检测细胞凋亡，用FL3通道分析结果会比FL2分析效果好。

Zoravae · 发表于 2023-5-5 09:23:00

niwanmao 发表于 2023-5-5 08:06
如确定染色步骤没问题，可能是药物无法有效诱导凋亡。想办法用CCCP之类的药物诱导一个阳性对照，确保实验 ...

之前有别的同学做过这类肿瘤细胞，可以诱导凋亡，是不是我没有预冷PBS的原因？但是我看染料的说明书，也没有让预冷PBS啥的，但是就是结果不好。我也很迷茫……

Zoravae · 发表于 2023-5-5 09:24:24

wxd 发表于 2023-5-5 08:23
不知道你用的是什么种类的细胞，但是我们作为一家实验外包公司，做细胞毒性实验，一般用1-5% DMSO处理24 h ...

胶质瘤细胞
DMSO用啥稀释的呀？

yxyyjs · 发表于 2023-5-5 13:43:57

Zoravae 发表于 2023-5-5 09:24
胶质瘤细胞
DMSO用啥稀释的呀？

dmso不用稀释的吧，算好量，直接加到培养液里让体积分数到5%就行

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