FITC单染检测细胞表面受体蛋白

ruyudeshui

我的实验是检测一个单抗蛋白与细胞表面受体的靶向结合能力。方案是先用单抗蛋白与细胞孵育，然后用FITC标记的二抗对结合的单抗蛋白进行标记，流式检测。
现在的问题是
1、阴性对照该如何选：是细胞+单抗蛋白，不加二抗；还是细胞不加单抗蛋白，只加二抗；
2、为什么我检测的平均荧光强度都在100内，但是文献上的荧光强度都是上千的？不是什么原因引起的，实验步骤还是二抗质量问题？
3、文献上此类实验都用多聚甲醛PBS固定，如果不用多聚甲醛固定会有什么影响？
4、再加入单抗蛋白孵育后，用PBS还是1%BSA-PBS洗掉未结合的抗体蛋白，用多少体积并且洗几次？
5、二抗孵育后，如果不洗掉未结合的二抗直接上机检测，会有影响吗？


此外，我上传的实验结果中001是阴性对照，由其散点图能看出我的仪器条件设置合理吗？检测样品中细胞状态怎么样？

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-8-30 20:44

                               
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我的实验是检测一个单抗蛋白与细胞表面受体的靶向结合能力。方案是先用单抗蛋白与细胞孵育，然后用FITC标记 ...

1、由于带荧光的二抗是属于非特异性结合，所以阴性对照最好用细胞直接加FITC二抗，这样才能体现荧光背景强度。如果用不加二抗作为阴性对照，就属于空白对照，明显会低于真正的阴性对照。
2、荧光强度跟荧光标记、电压等都有关系，如果你改用APC或PE标记，电压再调高，就可以达到。
3、是否固定问题不大。
4、如果单纯用PBS洗涤的时候，背景比较高（如拖尾现象比较明显等），那么建议用BSA＋PBS洗涤，否则只用PBS即可。体积不是问题，一般在1ml左右，洗涤2－3次。
5、二抗孵育之后，如果不洗涤，会使背景增高。

从这几张图片看，只出现峰的偏移，没有出现阳性峰，但我不知道你检测的是什么标记，也不知道文献中阳性的峰应该是怎么样分布，所以没法帮你判断结果好坏。

ruyudeshui

谢谢老师的指点，二抗孵育之后该怎么洗，也像一抗那样一般在1ml左右，洗涤2－3次吗？
我检测的肿瘤细胞表面因子HER2受体蛋白，附上文献中相关图及其解释，请老师帮忙分析？

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-8-30 21:59

                               
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谢谢老师的指点，二抗孵育之后该怎么洗，也像一抗那样一般在1ml左右，洗涤2－3次吗？
我检测的肿瘤细胞表面 ...

1、二抗的洗涤是跟一抗一样。
2、我之前讲阴性对照的时候不自觉的使用了你所设的两个选择，流式细胞术中的阴性对照概念是指不表达某种标记的细胞。我们平时检测抗原表达时，其实的确应该如这幅图解释中所说的那样，应该用同型对照，就是使用一个跟一抗相同来源的非特异性抗体。例如这幅图中所用的一抗是IgG2a来源的，所以他们就用一个非特异性的IgG2a亚型作为同型，这样检测出来的才能作为真正的背景，也就是每个小图中的左侧曲线。

ruyudeshui

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老师，您的意思是用同型对照作为阴性对照，划Marker吗？那我是不是就不需要做细胞+单抗蛋白或细胞只加二抗的对照了？我也有做不表达HER2受体细胞作为对照；
还有老师说从我的结果看，只出现峰的偏移，没有出现阳性峰，是什么意思？还有就是什么叫特异性荧光和非特异性荧光，我的检测结果是什么样的荧光，是正确的吗？

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-8-31 19:53

                               
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老师，您的意思是用同型对照作为阴性对照，划Marker吗？那我是不是就不需要做细胞+ ...

同型对照＝使用跟一抗同样来源的非特异性抗体（如图中的IgG2a），标记步骤一样。
阴性对照＝不表达HER2受体细胞
这两个至少要有一个。
关于峰的偏移，就是说相对于阴性对照或同型对照，标本检测出来的表达峰出现向右偏移，而阴性峰却看不到，这可能是真正的阳性，也可能是非特异性荧光。但从你提供的文献资料图片看，HER2受体的表达应该本身就是这样子。那么只要你的DATA.001是使用阴性对照或者同型对照，我觉得你的结果应该是可以的。

ruyudeshui

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终于明白了，万分感激，谢谢老师

CRP

ruyudeshui 发表于 2011-8-30 21:59

                               
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谢谢老师的指点，二抗孵育之后该怎么洗，也像一抗那样一般在1ml左右，洗涤2－3次吗？
我检测的肿瘤细胞表面 ...

您做的怎么样？现在

我也需要做一个类似的实验，多多指教！