流式如何检测细胞 胞吞大分子药物

赤道与北极

大家好，大分子抗体药物，例如靶向细胞表面CD3分子，如何检测T细胞有没有胞吞该药物呢？有没有老师用流式做过类似实验或者设计呢，谢谢

niwanmao

未做过，仅从理论上进行探讨：
是否可用结合该抗体药物的荧光素二抗，结合上去检测。但是因为是要检测胞吞作用，所以做一管常规染色的，反映结合表面的；再做一管固定、破膜的，同时反映表面和胞内的。
两者相减，相当于是被胞吞到胞内的抗体药物水平。

wxd

可以给这个抗体连上荧光标签，跟细胞共培养之后用流式或者酶标仪检测荧光强度。最好做个时间梯度或者浓度梯度，以排除表面结合。

悠游

我也没什么经验，不过感觉上思路可以如下

首先不知道你是要直接检测样本还是做体外实验：

检测样本的话，感觉可以按照倪老师提供的方案进行方法开发，当然你需要先筛选到合适的二抗。
动物样本比较方便，使用抗人的Fc抗体应该就行；如果是临床样本的话，抗体筛选可能需要麻烦一点，同时要注意封闭。

做体外实验的话，可以用荧光素直标药物与细胞共培养，然后二抗染表面。
以上思路仅供参考。

赤道与北极

niwanmao 发表于 2023-5-11 19:51
未做过，仅从理论上进行探讨：
是否可用结合该抗体药物的荧光素二抗，结合上去检测。但是因为是要检测胞吞 ...

老师好，如果表变结合药物很多，,荧光强度很高，然后由固定破膜引起的表面荧光强度改变，会不会很可能会比胞内染色增加的荧光强度要大？

赤道与北极

wxd 发表于 2023-5-12 08:33
可以给这个抗体连上荧光标签，跟细胞共培养之后用流式或者酶标仪检测荧光强度。最好做个时间梯度或者浓度梯 ...

表面是个高表达靶点，表面的信号强度会很大，如果不除去表面的信号，如果不是大量胞吞，信号差异可能反映不出来。

赤道与北极

悠游 发表于 2023-5-12 09:11
我也没什么经验，不过感觉上思路可以如下

首先不知道你是要直接检测样本还是做体外实验：

体外实验，只表染可能不行，即使会胞吞，药物量除非刚刚好够表面抗原结合的量，若是多一些，即使胞吞了，表面结合的药物分子也不会比胞吞后少，会是在一个大致的水平

niwanmao

赤道与北极 发表于 2023-5-12 09:12
老师好，如果表变结合药物很多，,荧光强度很高，然后由固定破膜引起的表面荧光强度改变，会不会很可能会 ...

如果胞吞量比较少，可能需要通过荧光显微镜观察了。

悠游

赤道与北极 发表于 2023-5-12 09:23
体外实验，只表染可能不行，即使会胞吞，药物量除非刚刚好够表面抗原结合的量，若是多一些，即使胞吞了， ...

可以用荧光显微镜或者激光共聚焦，二抗用不同颜色的荧光，然后两种荧光图片叠加，分析胞吞比例

Adam2022

如果固定破膜的方式，担心固定前后荧光强度改变不好分析，可以样本一分为二管，用两种不同荧光的二抗分别检测，分析两管各自的数据。

如果不想做固定破膜，怕对膜表位或药物有影响，我想你的样本是体外给药后的对吧，可以将样本一分为二管，一管用 预先荧光标记的药物（相当于常规荧光抗体）染色[直标]，阳性结果代表游离的CD3，另一管用抗药物的荧光二抗[间标]，阳性结果代表表面占位上的药物，如果直标和间标都没有阳性检出，反映靶点内吞，具体内吞率你可以参考这个逻辑算一算，应该可行的。