脾脏细胞调补偿无阳性峰

Ren

我们用小鼠脾脏细胞研磨（未消化，过了细胞筛）裂红获得的单细胞，细胞数在10E6~7/100μl左右，抗体浓度都是1:800，全是表面抗体但是都做了破膜处理（因为正式样本要染胞内），按照如图通道设计去调补偿，结果如图（包括空白管，各单标管（单标管中有一个是死活染料），调节的相应的电压在500-700的区间内，感觉已经很高了，我们不敢再提高，但基本都无明显的阳性峰）
请问各位老师，可能是什么原因？是否应该提高抗体浓度？

wxd

没有阳性群，可能是抗体变质的原因，也可能是抗体浓度不够的原因，还有可能是你染色操作的原因。
建议你先做一下抗体滴定实验，确定一下抗体的工作浓度，同时排除一下抗体变质的因素。
然后尝试直接染色（不固定破膜）的预实验，排除一下操作的原因，熟悉一下流式细胞仪的参数设置以及补偿调节，同时为在后续的正式实验中，验证“固定破膜是否会影响膜表面的抗体标记”提供参考。
另外看你的所有组别FSC坐标中都有大量压线的细胞，会不会是你的FSC通道电压太大了，导致你没有圈到要分析的细胞，而是圈到了细胞碎片？这个可以通过反圈门法（先不画P1门，直接分析各荧光通道的阳性细胞群，然后看阳性群在FSC/SSC坐标系中的位置）来确定。
“PMT voltage is not consistent among compensaton tubes”意思是各补偿管之间PMT电压不一致。PMT是光电倍增管，是将各通道的荧光信号转化为电信号的检测器，其灵敏度和电压有关。我们平时所说的调整各通道的电压，指的就是调整对应通道PMT的电压。做多色染色的补偿的时候，是一个电压设置对应一个补偿值的，如果调整补偿的时候，调整了其中一个通道的电压，需要把和这个通道有补偿的所有管都重新收集一遍，并重新调整补偿。在实际检测中，为了实验结果的准确性，我们通常会把所有的单阳管都重新收集一次。

Ren

另外，我们按照如图，选择自动调补偿之后出现了PMT voltage is not consistent among compensaton tubes的error，请问各位老师这个是什么原因？

家的感觉

Ren 发表于 2023-5-17 22:22
另外，我们按照如图，选择自动调补偿之后出现了PMT voltage is not consistent among compensaton tubes的e ...

咋感觉第一个图的前向和侧向电压偏高了，是不是细胞群已经跑出去了，似乎你圈的不是细胞群，而是细胞碎片，先把前向和侧向电压降低看看细胞群情况

Ren

家的感觉 发表于 2023-5-18 08:44
咋感觉第一个图的前向和侧向电压偏高了，是不是细胞群已经跑出去了，似乎你圈的不是细胞群，而是细胞碎片 ...

老师，我昨天调的时候曾尝试把框往右调，调到正中，整体阳性略有增加，仍然是一个峰，但也不是特别明显

niwanmao

1、如果要做自动调节补偿管，没必要破膜，从图上看，我怀疑是不是细胞都已经破碎了。
2、前述的错误提示，指的是各单染管之间，电压不一致。

Ren

niwanmao 发表于 2023-5-18 09:01
1、如果要做自动调节补偿管，没必要破膜，从图上看，我怀疑是不是细胞都已经破碎了。
2、前述的错误提示， ...

倪老师，我们考虑破膜是因为正式样本中有染胞内的，有一位老师和我们说破膜和不破膜的应该分开调两套补偿，我们感觉这个应该是考虑的细胞自发荧光破膜和不破膜不一样的问题

Ren

wxd 发表于 2023-5-18 08:51
没有阳性群，可能是抗体变质的原因，也可能是抗体浓度不够的原因，还有可能是你染色操作的原因。
建议你先 ...

老师，您说的调电压的部分，我可以理解为我要准备两套单标管，一套用于初步调节每一个荧光通道的电压使其阴阳性群分开，而后用另一套把所有单标管重新收一遍吗？比如PE和APC，我依次调节了PE的电压，收了PE的细胞，调节APC的电压，收了APC的细胞，然后重新收一遍PE的细胞，但是这样两次收PE的细胞结果不应该一样吗？毕竟在PE这个管中，它只是488激发，然后585收，APC的633好像并没有参与这个过程

wxd

不需要两套单标管，准备一套细胞比较多的单标管就可以了。收集两次，第一次初步调节各荧光通道电压其阴阳性群分开，而后把所有单标管重新收一遍

niwanmao

Ren 发表于 2023-5-18 09:12
倪老师，我们考虑破膜是因为正式样本中有染胞内的，有一位老师和我们说破膜和不破膜的应该分开调两套补偿 ...

背景荧光受固定、破膜影响，但补偿由荧光素内在属性决定，不受破膜影响。